葛根素對(duì)骨質(zhì)疏松模型大鼠細(xì)胞因子和骨代謝的影響

李強(qiáng) 任慧萌 朱濤 李偉延 白柳

1. 濟(jì)南市人民醫(yī)院手足外科，山東 濟(jì)南 250000

2. 濟(jì)南市人民醫(yī)院麻醉科，山東 濟(jì)南 250000

3. 盤(pán)錦職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)療護(hù)理分院，遼寧 盤(pán)錦 124000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是指絕經(jīng)期后女性卵巢功能衰退，雌激素水平下降，骨代謝失衡，導(dǎo)致骨量減少，骨強(qiáng)度降低，骨結(jié)構(gòu)退變，骨脆性增加為特征的全身性骨骼疾病[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子影響PMOP的發(fā)生和發(fā)展，細(xì)胞因子可通過(guò)影響骨細(xì)胞的分化、增殖、凋亡，從而影響骨重建過(guò)程[3]。葛根素(puerarin，Pue)屬于植物雌激素，可以產(chǎn)生類(lèi)雌激素樣活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制破骨細(xì)胞分化，改善骨代謝，增加骨量骨密度，減少骨吸收，促進(jìn)骨形成[4]。本研究通過(guò)觀察葛根素對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠細(xì)胞因子和骨代謝指標(biāo)的影響，探討其對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松細(xì)胞因子及骨礦化、骨吸收和骨形成的調(diào)節(jié)作用，為中草藥防治骨質(zhì)疏松的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

SPF級(jí)雌性Wistar大鼠46只，13周齡，未孕，體重230～260 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SYXK(京)2019-0005)。飼養(yǎng)于盤(pán)錦職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。苯甲酸雌二醇(100 μg/支，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20053392，浙江仙琚制藥股份有限公司)，葛根素注射液(2 mL：100 mg/支，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20044953，廣東新峰藥業(yè)股份有限公司)。血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、白介素-6(IL-6)和白介素-1(IL-1)、血清鈣(Ca)、磷(P)和堿性磷酸酶(ALP)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所，Ⅰ型膠原C端交聯(lián)肽(CTX)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)、Ⅰ型原膠原N端前肽(PINP)、骨鈣素(BGP)、I型膠原羧基末端肽(ICIP)試劑盒購(gòu)于瑞士羅氏公司，Lunari DXA型雙能X射線(xiàn)骨密度檢測(cè)儀購(gòu)于美國(guó)GE公司。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型：參照文獻(xiàn)“雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)”構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型[5]，嚴(yán)格無(wú)菌操作于大鼠背部正中線(xiàn)做長(zhǎng)約3 cm縱向切口，鈍性分離，逐層進(jìn)入腹腔，找到粉紅色菜花狀卵巢，結(jié)扎輸卵管，切除卵巢并止血，相同操作切除對(duì)側(cè)卵巢，徹底止血后間斷縫合，青霉素5萬(wàn)U/d預(yù)防感染治療3 d，1周后拆線(xiàn)。假手術(shù)組不切除卵巢，僅在卵巢周?chē)谐攘恐窘M織，其他操作步驟相同。術(shù)后所有大鼠均在同等條件下單籠飼養(yǎng)。

1.2.2分組及藥物處理：造模評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：造模8周后骨密度(BMD)峰值減少≥2.5 SD(標(biāo)準(zhǔn)差)。SD大鼠造模成功40只，造模成功率為83%。按隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(OVX組)、雌二醇組(OVX+E2組)、葛根素組(OVX+PUE組)。造模成功后第2天給予不同藥物干預(yù)，參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》：人與動(dòng)物體表面積等效劑量比值，換算成大鼠的給藥劑量[6]。Sham組和OVX組：皮下注射0.9% Nacl 5 mL/kg，1次/d；OVX+PUE組：皮下注射葛根素35 mg/kg，1次/d；OVX+E2組：皮下注射雌二醇150 μg/kg，1次/2 d，連續(xù)給藥8周。

1.2.3標(biāo)本取材：試驗(yàn)結(jié)束后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，股動(dòng)脈取血，4 ℃，3 000 r/min，離心5 min，分離血清，-20 ℃保存待測(cè)。解剖雙側(cè)股骨，0.9% Nacl沖洗，無(wú)菌生理鹽水濕紗布包裹，20 ℃保存。另留部分股骨4%多聚甲醛固定24 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)脫鈣14 d。

1.2.4檢測(cè)血清細(xì)胞因子指標(biāo)：取出上清液，所有操作嚴(yán)格參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，檢測(cè)各組大鼠血清細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1水平。

1.2.5檢測(cè)血清骨代謝指標(biāo)：取出上清液，采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，分別檢測(cè)血清骨礦化指標(biāo)：Ca、P；骨形成生化指標(biāo)：ALP、BGP、PICP；骨吸收生化指標(biāo)：TRAP-5b、ICIP、CTX。

1.2.6檢測(cè)骨組織骨密度：取出待測(cè)大鼠右股骨，在LUNAR雙能X線(xiàn)吸收掃描儀掃測(cè)，采用小物體Discovery Wi掃描模式，用儀器選定興趣區(qū)，以2.0 mm×2.0 mm為中心區(qū)域，應(yīng)用軟件分析計(jì)算BMD值。

1.2.7蘇木精-伊紅染色法(HE染色法)觀察骨組織形態(tài)學(xué)：參照HE染色法步驟操作，脫蠟去水、蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡觀察染色效果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清細(xì)胞因子指標(biāo)比較

OVX組較Sham組血清TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1均顯著增高(P<0.05)，OVX+E2組和OVX+PUE組較OVX組血清TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1均顯著降低(P<0.05)，以O(shè)VX+PUE組最低。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清細(xì)胞因子指標(biāo)比較Table 1 Comparison of serum cytokine indexes among each group of rats

2.2 各組大鼠血清骨礦化生化指標(biāo)

OVX組較Sham組血清Ca、P均顯著降低(P<0.05)，OVX+E2組和OVX+PUE組較OVX組血清Ca、P均顯著升高(P<0.05)，以O(shè)VX+PUE組最高。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清骨礦化生化指標(biāo)比較Table 2 Comparison of serum biochemical indicators of serum among each group of rats

2.3 各組大鼠血清骨形成生化指標(biāo)

OVX組較Sham組血清ALP、BGP、PICP均顯著增高(P<0.05)，OVX+E2組和OVX+PUE組較OVX組血清ALP、BGP、PICP均顯著降低(P<0.05)，以O(shè)VX+PUE組最降低。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清骨形成生化指標(biāo)比較Table 3 Comparison of biochemical indicators of serum bone formation among each group of rats

2.4 血清骨吸收生化指標(biāo)

OVX組較Sham組大鼠血清TRAP-5b、ICIP、CTX均顯著增高(P<0.05)，OVX+E2組和OVX+PUE組較OVX組血清TRAP-5b、ICIP、CTX均顯著降低(P<0.05)，以O(shè)VX+PUE組最低。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清骨吸收生化指標(biāo)比較Table 4 Comparison of serum biochemical markers of bone resorption among each group of rats

2.5 各組大鼠骨組織BMD

Sham組、OVX組、OVX+E2組、OVX+PUE組骨組織BMD(g/cm2)分別為：0.235±0.052、0.162±0.037、0.193±0.040、0.221±0.055。OVX組較Sham組股骨BMD顯著降低(P<0.05)，OVX+E2組和OVX+PUE組較OVX組股骨BMD均顯著升高(P<0.05)，以O(shè)VX+PUE組最高。

2.6 各組大鼠骨形態(tài)學(xué)改變

Sham組骨皮質(zhì)正常，骨板層次清晰整齊，結(jié)構(gòu)完整，骨松質(zhì)骨小梁數(shù)較多，粗大，排列規(guī)則有序，骨細(xì)胞較多，結(jié)構(gòu)清晰完整。OVX組骨皮質(zhì)明顯變薄，骨板層結(jié)構(gòu)差，骨小梁明顯稀少變細(xì)，排列紊亂，間距增寬，髓腔明顯擴(kuò)大，骨細(xì)胞明顯減少，脂肪空泡增多。OVX+E2組和OVX+PUE組骨皮質(zhì)明顯變厚，骨板層結(jié)構(gòu)尚完整，骨小梁數(shù)量增多增粗，排列較規(guī)則，連接成網(wǎng)，髓腔明顯縮小，骨細(xì)胞增多。見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色觀察股骨組織病理學(xué)變化(×200)A：Sham組；B：OVX組；C：OVX+E2組；D：OVX+PUE組Fig.1 HE staining to observe the pathological changes of the femur (×200). A: Sham group; B: OVX group; C: OVX+E2 group; D: OVX+PUE group

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子廣泛參與PMPO的發(fā)病機(jī)制[7]。雌激素和成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞相互作用，可抑制多種骨形成細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α)等的分泌，維持骨形成[8]。絕經(jīng)后雌激素水平降低，可通過(guò)介導(dǎo)一系列細(xì)胞因子分泌增加，參與骨代謝和骨重建，打破骨形成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡，骨吸收增加，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[9-10]。同樣，骨代謝相關(guān)細(xì)胞因子(如TNF-α、TGF、IL-1、IL-6、IL-11)等通過(guò)自分泌和(或)旁分泌方式影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化、增殖、成熟及凋亡，從而調(diào)節(jié)骨質(zhì)重建過(guò)程[11-12]。各種細(xì)胞因子之間相互作用，組成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，形成骨組織發(fā)育所特需的骨微環(huán)境，它們作用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，介導(dǎo)骨細(xì)胞的分化及成熟，參與正常的骨組織的代謝[13]。研究表明雌激素介導(dǎo)骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等對(duì)細(xì)胞因子的表達(dá)，激活OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)、增加TGF-β、IGF-1等的分泌，減少I(mǎi)L-1、IL-6、TNF-α等抑制性細(xì)胞因子的表達(dá)等[14]。

目前雌激素替代療法(HRT)是PMOP的首選治療方案[15]。HRT能夠防止絕經(jīng)后骨量、骨礦物丟失，預(yù)防骨折發(fā)生，緩解絕經(jīng)后癥狀，但HRT有引起心梗、肺栓塞、陰道出血，增加乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的危險(xiǎn)性，毒副作用令人擔(dān)憂(yōu)[16]。中醫(yī)藥歷史悠久，資源豐富、毒副作用相對(duì)較小，逐漸在防治PMOP研究中嶄露頭角。Pue作為分離得到的單體異黃酮類(lèi)植物提取物，具有雌激素類(lèi)似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)Pue能與內(nèi)源性雌激素受體結(jié)合，對(duì)骨產(chǎn)生雌激素樣作用，不僅能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化及礦化功能，直接抑制破骨細(xì)胞性骨吸收和分化，改善骨代謝；而且增加骨密度和骨礦含量，改善骨生物力學(xué)性能[17-18]。本研究結(jié)果表明OVX+PUE組血清細(xì)胞因子(TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1)、骨代謝指標(biāo)(Ca、P、ALP、BGP、PICP、TRAP-5b、ICIP、CTX)較OVX組均顯著降低(P<0.05)，OVX+PUE組股骨BMD較OVX組均顯著升高(P<0.05)，OVX+PUE組骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)尚完整，骨小梁數(shù)量增多增粗，排列規(guī)則，髓腔稍小。說(shuō)明Pue通過(guò)降低PMOP細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)成骨細(xì)胞合成，抑制破骨細(xì)胞生成，抑制骨轉(zhuǎn)換，降低骨吸收，促進(jìn)骨形成，調(diào)節(jié)骨代謝，提高骨密度，改善骨質(zhì)疏松骨組織結(jié)構(gòu)。同樣眾多研究表明Pue可能通過(guò)抑制細(xì)胞因子分泌而影響骨吸收和骨形成，發(fā)揮防治PMOP的作用[19-20]。李俊華等[21]研究表明Pue降低PMOP患者血清IL-4、IL-6、IL-10水平。梁倩等[22]研究表明葛根素改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠血清ALP、OPG、RANKL等骨代謝指標(biāo)。

總之，絕經(jīng)后雌激素缺乏與PMOP的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，細(xì)胞因子通過(guò)多種途徑參與骨代謝過(guò)程，對(duì)PMOP的發(fā)病起到了重要作用。Pue通過(guò)調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠炎性細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)骨代謝，促進(jìn)骨生成，改變骨結(jié)構(gòu)，發(fā)揮骨保護(hù)作用，但其防治PMOP的確切分子機(jī)制有待進(jìn)一步探討。全面而深入研究葛根素對(duì)防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制，從多角度、全方位為葛根素辨證防治骨質(zhì)疏松提供更全面的科學(xué)依據(jù)，中草藥為防治骨質(zhì)疏松的貢獻(xiàn)會(huì)越來(lái)越大。