基于PI3K/Akt通路研究利拉魯肽對2型糖尿病骨質疏松大鼠的作用

張瑩 周艷紅 李江雁 趙建林 吳蘇豫 熊承云 孫超

新鄉市中心醫院，河南 新鄉 453000

2型糖尿病性骨質疏松(type 2 diabetic osteoporosis，T2DOP)屬全身性代謝疾病，主要影響骨量丟失和骨組織改變，誘發病理性骨折，導致致殘率、死亡率增加[1]。尋找安全有效的治療方法是目前治療T2DOP的重點。利拉魯肽作為一種人胰高血糖素樣肽-1類似物，可直接或間接影響胰高血糖素分泌，從而改變胰島功能[2]。磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphateidylinositol-3 kinase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt)通路是重要的胰島素信號通路，是胰島素發揮作用的重要傳導通路[3]；同時亦是骨代謝的主要調節因子，可以定向誘導骨分化，促進骨形成[4]。但利拉魯肽是否通過PI3K/Akt通路在T2DOP中發揮作用尚不清楚。因此，本研究通過高脂高糖飼料、鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)并摘除卵巢誘導建立T2DOP大鼠模型，探究利拉魯肽對T2DOP大鼠的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雌性SD大鼠，SPF級，購自華中科技大學實驗動物中心，體重(200±10)g，動物生產許可證號：SCXK(鄂)2019-0007，動物使用許可證號：SYXK(鄂)2019-0021，動物質量合格證號：JS19034721。在溫度(24±0.5)℃、光照/黑暗(12/12) h、正常飲水攝食條件下飼養。對實驗動物實行人道主義關懷，符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

PI3K抑制劑LY294002(成都易萊生物科技有限公司，批號：T2008)；利拉魯肽注射液(諾和諾德中國制藥有限公司，規格3 mL∶18 mg，批號：20190317)；STZ(美國Sigma公司，批號：S0131)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色試劑盒(上海生工生物技術公司，批號：E607318)；聚偏氟乙烯膜(碧云天生物技術研究所，批號：FFP28)；大鼠骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、細胞核因子KB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-kB ligand，RANKL)酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、羊抗鼠磷酸化-PI3K(p-PI3K)、PI3K、磷酸化-Akt(p-Akt)、Akt、GAPDH一抗、羊抗鼠IgG二抗(英國abcam公司，批號分別為：ab255723、ab269553、ab109006、ab139307、ab00133、ab8805、ab151279、ab6721)。血糖儀(上海羅氏制藥有限公司，型號：BG-102)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號：CKX53)；雙能X射線密度儀(上海碩舟電子科技有限公司，型號：CB3351MD)；凝膠成像系統(美國伯樂公司，型號：Gel Doc XR+)。

1.3 動物分組及給藥處理

高脂高糖飼料提前混勻，各組分比例：正常飼料66.5%、豬油30%、膽固醇2.5%、脫氧膽酸1%。大鼠參考文獻[5]建立T2DOP模型，高脂高糖飼料飼養大鼠8周，8周末禁食12 h后腹腔注射30 mg/kg STZ建立2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)模型，T2DM模型以尾靜脈采血空腹血糖水平高于16.7 mmol/L為造模成功，42只大鼠模型成功30只，成功率71.43%；T2DM模型建立成功后采用摘除卵巢方法制備骨質疏松(osteporsis，OP)模型，30只大鼠按隨機數表法分為模型組、利拉魯肽組、利拉魯肽+LY294002組，每組10只；另設正常飼養大鼠10只作為正常組。利拉魯肽組皮下注射0.6 mg/kg利拉魯肽[6]，利拉魯肽+LY294002組皮下注射0.6 mg/kg利拉魯肽和1 mg/kg LY294002的混合物[7]，正常組和模型組皮下注射等體積生理鹽水，1次/d，連續8周。

1.4 指標檢測

1.4.1體重檢測：實驗結束后稱量大鼠體重。

1.4.2血糖儀檢測血糖水平：尾靜脈抽血，血糖儀檢測尾靜脈血中空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)水平。

1.4.3HE染色觀察大鼠股骨組織形態：立即處死大鼠，股骨組織置于4%多聚甲醛中固定，EDTA脫鈣液脫鈣處理。HE染色試劑盒檢測大鼠股骨組織情況，顯微鏡下拍照觀察。

1.4.4ELISA檢測血清中OPG、RANKL水平：尾靜脈血室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，取上清，大鼠OPG、RANKL ELISA試劑盒檢測血清中OPG、RANKL水平。

1.4.5雙能X射線吸收法測定股骨組織骨密度：雙能X射線密度儀檢測各組股骨組織骨密度。

1.4.6蛋白免疫印跡檢測股骨組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平：股骨組織立即浸入液氮中，研磨至細粉，加入RIPA強效裂解液，冰上勻漿30 min，4 ℃離心機3 500 r/min離心20 min，吸取上清即為股骨組織總蛋白。蛋白樣品經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離轉至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉；分別加入一抗p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH(均為1∶2000稀釋)，4 ℃孵育過夜；加入羊抗鼠IgG二抗(1∶5000稀釋)，室溫孵育1 h。凝膠成像系統對條帶進行灰度分析。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 利拉魯肽對大鼠體重及FBG的影響

與正常組相比，模型組大鼠體重、FBG水平升高(P<0.05)；與模型組相比，利拉魯肽組大鼠體重、FBG水平降低(P<0.05)；與利拉魯肽組相比，利拉魯肽+LY294002組大鼠體重、FBG水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠體重、FBG水平比較Table 1 Comparison of body weight and FBG level among rats in 4 groups (n=10,

2.2 利拉魯肽對大鼠股骨組織形態的影響

正常組骨小梁形態正常；模型組骨小梁破壞嚴重，出現明顯斷裂現象，變薄和分離明顯；利拉魯肽組骨小梁空隙間隔有所緩解，數量有所增加，厚度有所增厚；利拉魯肽+LY294002組相較于利拉魯肽組骨小梁斷裂明顯，厚度降低。見圖1。

圖1 4 組大鼠股骨組織形態情況(HE染色，400×)A：正常組，B：模型組，C：利拉魯肽組，D：利拉魯肽+LY294002組Fig.1 The morphology of the femur in rats of the 4 groups (HE staining, 400×)A: Normal group; B: Model group; C: Liraglutide group; D: Liraglutide + LY294002 group

2.3 利拉魯肽對大鼠血清中OPG、RANKL水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中OPG水平降低、RANKL水平升高(P<0.05)；與模型組相比，利拉魯肽組大鼠血清中OPG水平升高、RANKL水平降低(P<0.05)；與利拉魯肽組相比，利拉魯肽+LY294002組大鼠血清中OPG水平降低、RANKL水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清中OPG、RANKL水平比較Table 2 Comparison of serum OPG and RANKL levels in rats of the 4 groups

2.4 利拉魯肽對大鼠股骨組織骨密度的影響

與正常組相比，模型組大鼠股骨組織骨密度降低(P<0.05)；與模型組相比，利拉魯肽組大鼠股骨組織骨密度升高(P<0.05)；與利拉魯肽組相比，利拉魯肽+LY294002組大鼠股骨組織骨密度降低(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠股骨組織骨密度比較Table 3 Comparison of bone mineral density of the femur in rats of the 4 groups (n=10,

2.5 利拉魯肽對大鼠股骨組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠股骨組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組相比，利拉魯肽組大鼠股骨組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平升高(P<0.05)；與利拉魯肽組相比，利拉魯肽+LY294002組大鼠股骨組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平降低(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 4組大鼠股骨組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白情況A：正常組；B：模型組；C：利拉魯肽組；D：利拉魯肽+LY294002組Fig.2 p-PI3K, PI3K, p-Akt, and Akt proteins in the femoral tissues of rats in the 4 groupsA: Normal group; B: Model group; C: Liraglutide group; D: Liraglutide + LY294002 group

表4 4組大鼠股骨組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平比較Table 4 Comparison of protein levels of p-PI3K, PI3K, p-Akt, and Akt in the femur in rats of the 4 groups (n=10,

3 討論

糖尿病可誘發多個系統和器官損害，在骨骼系統中導致骨質疏松、骨折愈合延遲或不愈合現象，造成骨形成和骨吸收打破，使骨代謝紊亂，影響患者生活質量及預后[8]。在發病機制中，胰島素分泌不足、胰島素抵抗，胰高血糖素分泌增加是2型糖尿病的重要發病機制[9]。而抑制胰高血糖素高分泌研究相對較少。胰高血糖素樣肽-1不僅可改善胰島β細胞功能、增加胰島β細胞數量，同時可抑制胰島α細胞上N型鈣離子通道等，共同作用抑制胰高血糖素的分泌，從而改善胰島α細胞對葡萄糖的敏感性，從而達到降血糖的目的[10]，而利拉魯肽作為胰高血糖素樣肽-1類似物，可能具有類似效應。本研究發現，與正常組相比，模型組體重、FBG水平升高，骨小梁破壞嚴重、骨密度降低，提示T2DOP大鼠模型制備成功。而利拉魯肽作用后發現大鼠體重下降、血糖水平有所降低，骨小梁結構有所緩和，骨組織功能得以緩解，骨密度升高，證明利拉魯肽可以緩解T2DOP癥狀，但其作用機制尚需研究。

OPG作為可溶性糖蛋白，對骨組織有特異性作用，可誘導破骨細胞分化、成熟等，可增加骨密度、抑制破骨細胞生成，是骨細胞分化的決定性分子[11]。RANKL是破骨細胞前體細胞分化的關鍵因子，能夠促進破骨細胞分化、促進骨吸收，是調節骨質重建的關鍵因子[12]。OPG與RANKL相互調節，可評估骨損傷情況，升高OPG、降低RANKL可阻斷鈣質流失和骨質流失[13]。PI3K/Akt通路存在于所有哺乳動物中，且受細胞外一系列信號的轉導[14]，其中PI3K作為一種信號分子，參與胰島素信號通路過程，導致T2DOP的產生[15]；LY294002作為PI3K抑制劑，可特異性抑制PI3K上p110亞單位，阻止下游3,4,5-三磷酸肌醇底物的產生[16]。Akt作為一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，PH結構域可與3,4,5-三磷酸肌醇底物結合，使得Akt激酶聚集于質膜上，使得相關基因磷酸化，進而影響下游的相關靶基因[17]。而Akt是由RANKL在破骨細胞生成過程中激活的一種信號轉導分子，RANKL可進入細胞，介導骨髓基質細胞或成骨細胞分泌的相關因子與破骨細胞前體細胞表面的受體結合，同時再介導Akt通路等參與破骨細胞成熟[18]。且PI3K/Akt通路在糖尿病[19]和骨質疏松[20]中均研究廣泛。本研究發現，與正常組相比，模型組大鼠血清中OPG水平、股骨組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平降低，血清中RANKL水平升高，提示在T2DOP大鼠中PI3K/Akt通路受到抑制，從而降低骨密度、增加破骨細胞生成、分化，影響骨質重建。添加利拉魯肽后PI3K/Akt通路被激活從而升高OPG水平、降低RANKL水平，導致骨密度增加且同時抑制破骨細胞分化，鈣質流失和骨質流失，從而緩解高脂肪導致的骨質疏松。在利拉魯肽基礎上添加LY294002可逆轉PI3K/Akt通路，且與單純的添加利拉魯肽相比，大鼠骨質疏松癥狀嚴重，說明利拉魯肽在T2DOP中通過激活PI3K/Akt通路發揮作用。

綜上所述，利拉魯肽在T2DOP大鼠中通過激活PI3K/Akt通路增加骨密度、抑制破骨細胞生成從而緩解疾病。但PI3K/Akt通路對骨密度、破骨細胞的具體作用機制尚不清楚，是下一步研究重點。