異補骨脂素通過PPAR-γ-Axin2-Wnt信號通路調節對大鼠骨代謝的影響

王軍 王劍 魯敏 牧亭亭 耿亞會

摘要 目的：探討異補骨脂素通過PPAR-γ-Axin2-Wnt信號通路調節對大鼠骨代謝的影響。方法：選擇雌性大鼠40只，隨機分為模型組和異補骨脂素組，各20只，實驗12周后，對大鼠骨密度、骨組織形態進行觀察，并檢測各組大鼠血清骨代謝生化指標情況，采用蛋白質免疫印跡法（Western blotting）檢測PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白的表達情況。結果：12周后，模型組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均低于異補骨脂素組（P<0.05）;異補骨脂素組大鼠血清鈣、磷及抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate Resistant Acid Phosphatase，TRACP）水平低于模型組，血清堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）水平高于模型組（P<0.05）;骨組織形態計量學分析結果顯示，模型組大鼠骨小梁稀疏、斷裂明顯，而異補骨脂素組大鼠骨小梁面積百分數和骨小梁數目明顯增加，骨小梁分離度明顯下降（P<0.05）。12周后，與模型組比較，異補骨脂素組PPAR-γ和Axin2蛋白水平下調，β-catenin蛋白表達明顯增加（P<0.05）。結論：異補骨脂素可能通過抑制Axin2/PPAR-γ信號通路，激活Wnt信號通路，改善大鼠骨代謝。

關鍵詞 異補骨脂素;骨質疏松;骨代謝;骨組織形態;Wnt信號通路;PPAR-γ蛋白;Axin2蛋白;β-catenin蛋白

Effects of Isopsoralen on Bone Metabolism in Rats Via PPAR Gamma-Axin 2-Wnt Signal Regulation

WANG Jun，WANG Jian，LU Min，MU Tingting，GENG Yahui

（Department of Traumatic Orthopaedics，People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region，Hohhot 010000，China）

Abstract Objective：To investigate the effects of isopsoralen on bone metabolism in rats through PPAR-gamma-Axin2-Wnt signal regulation.Methods：A total of 40 female rats were randomly divided into a model group and an isopsoralen group with 20 rats in each group.After 12 weeks of experiment，the bone mineral density（BMD） and bone histomorphology of rats were observed，and the biochemical indexes of bone metabolism in serum of rats in each group were detected.The expressions of PPAR-gamma，Axin 2 and beta-catenin protein were detected by Western blotting.Results：After 12 weeks，BMD values of femur，pelvis，spine and whole body in model group were lower than those in isopsoralen group（P<0.05）; serum Ca，P and TRACP levels in isopsoralen group were lower than those in model group，and serum ALP levels were higher than those in model group（P<0.05）; bone histomorphometric analysis showed that the trabeculae of model group were sparse and fractured obviously.The percentage of bone trabecular area and the number of bone trabeculae increased significantly，and the degree of trabecular segregation decreased significantly（P<0.05）.After 12 weeks，compared with model rats，PPAR-gamma and Axin 2 protein levels in isopsoralen group were down-regulated and beta-catenin protein expression was significantly increased（P<0.05）.Conclusion：Isopsoralen may improve the abnormal bone metabolism in rats by inhibiting Axin2/PPAR gamma signaling pathway，activating Wnt signaling pathway and improving bone metabolism in rats.

Keywords Isopsoralen; Osteoporosis; Bone metabolism; Bone histomorphology; Wnt signaling pathway; PPAR-γ protein; AXIN2 protein; β-Catenin protein

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.011

骨質疏松（Osteoporosis，OP）是臨床常見的全身性骨骼疾病，其特征表現為骨組織微結構受損、骨量降低及骨脆性增加[1]。OP易導致骨折，引起患者致殘和致死率增高，嚴重影響患者的生命質量[2]。目前OP已成為全球范圍的一個公共健康問題，因此，對OP的防治具有重要的臨床意義[3]。目前臨床上OP的藥物治療雖然具有一定療效，但其不良反應較多，且經濟成本較高，因此探尋一種安全、不良反應小、費用低廉的藥物治療方法顯得十分必要[4]。異補骨脂素是從豆科植物中提取的一種香豆素類化合物，具有促進骨代謝的作用[5]。本研究通過動物實驗，探討異補骨脂素調控大鼠PPAR-γ-Axin2-Wnt信號通路的機制及對骨代謝的影響，為防治OP提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用6月齡雌性健康大鼠[動物批準號：SCXK（京）2018-0013]40只，均購于北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養于清潔級實驗室中，所有大鼠自由飲水攝食。本研究經我院實驗動物管理與動物福利倫理委員會審批通過（倫理審批號：20180121）。

1.1.2 藥物

地塞米松鈉注射液（天津藥業焦作有限公司，國藥準字H41020035）、異補骨脂素（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：20180122）。

1.1.3 試劑與儀器

骨密度儀（NORLAND公司，美國，型號：XR-46）、電子天平（日本島津公司，型號：AEL-40SM）、全自動酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司，型號：Read Max 1900Plus）、顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：Olympus IX71）、電泳儀（美國Bio-Rad公司，型號：Bio-RaD）;鈣（Ca）檢測試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：180103）、磷（P）檢測試劑盒（寧波博泰生物技術有限公司，批號：170903）、堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒（寧波博泰生物技術有限公司，批號：171104），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）檢測試劑盒（寧波博泰生物技術有限公司，批號：180115）、PPAR-γ抗體（美國Ssanta Cruz公司，批號：180112）、β-catenin抗體（美國Ssanta Cruz公司，批號：180107）和Axin2抗體（美國SsSanta Cruz公司，批號：180110）;Trizol總RNA提取試劑（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：180103）、Western blotting及凝膠電泳試劑（南京凱基生物有限公司，批號：171014）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將40只健康大鼠采用隨機數字表法分為模型組和異補骨脂素組，每組20只。各組大鼠右側臀部肌內注射地塞米松鈉注射液（2.5 mg/kg），每周2次，連續注射12周。

1.2.2 給藥方法 自造模之日起，模型組大鼠給予10 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，異補骨脂素組給予異補骨脂素混懸液治療，劑量為25 mg/（kg·d），每周停1 d，連續治療12周，期間密切觀察各組大鼠的生理反應及生活習性變化情況。

1.2.3 檢測指標與方法

大鼠骨密度及血清骨代謝檢測：12周后將各組大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，采用骨密度儀對各組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度進行檢測。檢測完畢后，腹部脫毛后正中縱切開、分離肌肉和筋膜，將腹動脈暴露，抽取2.0 mL血液樣本，然后將腹動脈結扎。血標本采用離心機離心（離心半徑：10 cm）10 min，取上清，-80 ℃備存待測。采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清鈣、磷、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）及抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate Resistant Acid Phosphatase，TRACP）水平，嚴格按照相關劑盒使用說明書進行操作。

大鼠骨組織形態計量學分析：12周后將各組大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，處死大鼠，進行解剖，取第四腰椎骨（L4），放入冷處理后的2.5%戊二醛中固定12 h，常溫下脫鈣至大頭針能刺進骨密質為止，包埋劑進行包埋，切片機冰凍切片（厚度15 μm），粘貼于載玻片上，-20 ℃備存待測。采用改良番紅O-固綠軟骨染色液試劑盒染色處理后，進行骨組織形態計量學分析，每只大鼠取3張切片，每張切片觀察2個視野，顯微鏡觀察并拍照，采用Image-Pro Plus彩色醫學圖文分析系統對骨小梁形態進行分析，觀察骨小梁面積百分數、骨小梁分離度及骨小梁數目情況。

PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白表達：采用Western blotting法檢測骨組織PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白表達：12周后，處死大鼠取右側股骨頭，碾碎后倒入勻漿器，加入裂解液混勻，按照Trizol總RNA提取試劑盒說明書進行操作，提取總蛋白，-80 ℃下凍存，將總蛋白溶入等體積的緩沖液中煮沸10 min，經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離蛋白，然后轉印到聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene Fluoride）上，放入封閉液中搖動1 h，加入一抗（PPAR-γ、β-catenin和Axin2抗體均為1∶500稀釋）孵育，4 ℃下過夜。二抗孵育（1∶200 0稀釋）12 h，免疫熒光增強法顯色，PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白的表達量與GAPHD的灰度比值表示。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組大鼠的骨密度情況

12周后，異補骨脂素組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均高于模型組（P<0.05）。見表1。

2.2 2組大鼠血清骨代謝情況

12周后，異補骨脂素組大鼠血清鈣、磷及TRACP水平低于模型組，血清ALP水平高于模型組大鼠（P<0.05）。見表2。

2.3 2組大鼠骨組織形態情況

12周后，骨組織形態計量學分析結果顯示，與補骨脂素組大鼠比較，模型組大鼠骨小梁稀疏、斷裂明顯（圖1），而異補骨脂素組大鼠骨小梁面積百分數和骨小梁數目明顯增加，骨小梁分離度明顯下降（P<0.05）。見表3。

2.4 2組大鼠骨組織PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白的表達情況

12周后，與模型組大鼠比較，異補骨脂素組PPAR-γ和Axin2蛋白水平下調，β-catenin蛋白表達明顯增加（P<0.05）。見表4，圖2。

3 討論

OP是一個全球性的公共衛生問題，隨著我國老齡化進程的加快，OP的發病率呈逐年增長的趨勢[6]。OP主要是骨吸收和骨形成的骨代謝失衡引起[7]。受各種因素影響（年齡、內分泌、遺傳及環境等因素），骨形成減弱或骨吸收增強時，機體會發生OP，并會呈持續性發展，極易導致各種骨折發生，給患者的生命質量帶來嚴重影響，因此對OP的防治具有十分重要的臨床意義[8-9]。大鼠是OP動物模型最常用的動物之一，其OP模型穩定性好，并可重復[10]。本研究通過地塞米松誘導建立OP大鼠模型進行實驗研究，對研究人類OP有著積極的指導意義。

臨床上對OP的藥物治療常采用雌激素替代療法，可有效延緩OP病情的發展，但其引起水腫、高血壓及癡呆等不良反應的風險較高[11]。近年來尋找和篩選中藥中與雌激素相類似的實驗研究成為熱點。植物雌激素是存在于植物中的一種活性成分，可與雌激素受體特異性的結合，發揮治療OP的效果，又可避免不良反應[12]。異補骨脂素是從豆類植物中提取的一種化學活性成分，具有溫脾止瀉、溫補腎陽的功效[13]。相關研究證實，異補骨脂素可促進骨代謝，起到防治骨質疏松的作用[14]。本研究結果顯示，12周后，異補骨脂素組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均高于模型組，異補骨脂素組大鼠骨小梁面積百分數和骨小梁數目明顯增加，骨小梁分離度明顯下降。這可能是因為異補骨脂素可發揮類似雌激素的作用，可有效控制大鼠的骨量流失，促進大鼠成骨細胞增殖，一定程度改善骨小梁微結構，起到防治OP的作用。

鈣和磷是機體必需的微量元素，可在骨代謝中起到重要作用[15]。ALP可由成骨細胞分泌，可參與成骨細胞的分化、增殖及遷移，可作為反映成骨細胞變化的標志物[16]。TRACP可由破骨細胞分泌，可反映破骨細胞的活性[17]。本研究結果顯示，12周后，異補骨脂素組大鼠血清鈣、磷及TRACP水平低于模型組，血清ALP水平高于模型組大鼠（P<0.05），這是因為通過異補骨脂素治療，可有效刺激成骨細胞的骨形成，ALP水平上升，同時抑制破骨細胞的骨吸收，TRACP水平下降，另外可降低血清鈣和磷水平，促進破骨細胞活性和骨吸收，促進骨代謝效果。

骨髓細胞大部分為脂肪細胞，其在骨代謝方面具有重要的作用，脂質代謝紊亂被認為可能是骨質疏松的病因之一[18]。PPAR-γ蛋白是一種核激素受體，會抑制成骨細胞特異轉錄因子表達，造成骨形成減弱，并可促進破骨細胞發育，造成骨吸收增加[19]。PPAR-γ可促進骨髓細胞向脂肪細胞分化，導致脂質代謝紊亂[20]。Wnt信號通路在成骨細胞分化和增殖中起重要作用，β-catenin蛋白是Wnt信號通路的主要成分，可啟動Wnt信號通路[21]。Axin2是一種骨架蛋白，可抑制Wnt信號通路的激活[22]。本研究結果顯示，12周后，與模型組大鼠比較，異補骨脂素組PPAR-γ和Axin2蛋白水平下調，β-catenin蛋白表達明顯增加。這可能是因為異補骨脂素可有效抑制下調PPAR-γ表達，減少骨髓內的脂肪組織堆積，避免骨髓脂質代謝紊亂。通過減少PPAR-γ的活化，可間接下調Axin2的表達，抑制Axin2/PPAR-γ信號通路參與脂質代謝，并可阻斷Axin2對Wnt信號通路的抑制，上調β-catenin蛋白表達，使β-catenin進入細胞核后與核內轉錄因子形成復合體，最終啟動Wnt信號通路，實現對大鼠骨髓脂質代謝的調節，進而影響其骨代謝，促進骨形成。

綜上所述，異補骨脂素可能通過抑制Axin2/PPAR-γ信號通路，激活Wnt信號通路，改善大鼠骨代謝異常，促進骨形成，可為OP防治新藥物的開發提供新思路，帶來良好的社會與經濟效益。

參考文獻

[1]Ganguly P，El-Jawhari JJ，Giannoudis PV，et al.Age-related Changes in Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells：A Potential Impact on Osteoporosis and Osteoarthritis Development[J].Cell Transplant，2017，26（9）：1520-1529.

[2]Ge DW，Wang WW，Chen HT，et al.Functions of microRNAs in osteoporosis[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（21）：4784-4789.

[3]Verbovoy AF，Pashentseva AV，Sharonova LA.Osteoporosis：Current state of the art[J].Ter Arkh，2017，89（5）：90-97.

[4]張學武，姚海紅，梅軼芳，等.全國多中心使用糖皮質激素風濕病患者骨質疏松調查[J].中華臨床免疫和變態反應雜志，2017，11（3）：277-284.

[5]劉銳，楊小杰，李鑫，等.異補骨脂素對去卵巢大鼠骨代謝的影響研究[J].中國骨質疏松雜志，2017，23（6）：807-811.

[6]Xie F，Zhou B，Wang J，et al.Microstructural properties of trabecular bone autografts：comparison of men and women with and without osteoporosis[J].Arch Osteoporos，2018，13（1）：18.

[7]Mu WQ，Huang XY，Zhang J，et al.Effect of Tai Chi for the prevention or treatment of osteoporosis in elderly adults：protocol for a systematic review and meta-analysis[J].BMJ Open，2018，8（4）：e020123.

[8]Sedlak CA，Roller CG，van Dulmen M，et al.Transgender Individuals and Osteoporosis Prevention[J].Orthop Nurs，2017，36（4）：259-268.

[9]Nakamura Y，Suzuki T，Kato H.Denosumab significantly improves bone mineral density with or without bisphosphonate pre-treatment in osteoporosis with rheumatoid arthritis：Denosumab improves bone mineral density in osteoporosis with rheumatoid arthritis[J].Arch Osteoporos，2017，12（1）：80.

[10]馬濤，王通.運動對廢用性骨質疏松大鼠骨代謝和破骨細胞分化OPG-RANKL-RANK系統的影響[J].中國運動醫學雜志，2017，36（7）：578-585.

[11]Baji P，Gulácsi L，Horváth C，et al.Comparing self-perceived and estimated fracture risk by FRAX of women with osteoporosis[J].Arch Osteoporos，2017，12（1）：4.

[12]陳夢，趙丕文，趙笛，等.中藥植物雌激素的藥理作用研究進展[J].江蘇中醫藥，2017，49（4）：82-85.

[13]劉俊岑，劉海洋，劉國良，等.異補骨脂素對紫外線誘導人真皮成纖維細胞損傷的保護作用及機制研究[J].國際中醫中藥雜志，2018，40（4）：339.

[14]張盼陽，王琴，袁曉美，等.異補骨脂素單次給藥在大鼠體內的藥代動力學研究[J].中國臨床藥理學雜志，2018，34（14）：1689-1692.

[15]林上進，程群，邵云潮，等.血骨代謝指標及骨密度與骨組織鈣、磷及金屬微量元素含量的相關性[J].中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志，2017，10（6）：513-518.

[16]劉爽，張玉蓮，畢聰聰，等.補腎法中藥對去卵巢大鼠骨質疏松骨代謝指標的影響[J].中國老年學雜志，2017，37（3）：529-530.

[17]胡詠新，孫利，褚曉秋，等.左歸丸對甲強龍脈沖治療Graves眼病骨代謝水平的影響[J].南京中醫藥大學學報，2017，33（2）：118-121.

[18]李莉莉，鐘佩茹.非創傷性股骨頭壞死發病相關因素及信號通路機制的研究進展[J].醫學綜述，2018，24（1）：22-27.

[19]Sun H，Zhu X，Cai W，et al.Hypaphorine Attenuates Lipopolysaccharide-Induced Endothelial Inflammation via Regulation of TLR4 and PPAR-γ Dependent on PI3K/Akt/mTOR Signal Pathway[J].Int J Mol Sci，2017，18（4）：844.

[20]Mori H，Okada Y，Tanaka Y.The Effects of Pioglitazone on Bone Formation and Resorption Markers in Type 2 Diabetes Mellitus[J].Intern Med，2017，56（11）：1301-1306.

[21]Nusse R，Clevers H.Wnt/β-Catenin Signaling，Disease，and Emerging Therapeutic Modalities[J].Cell，2017，169（6）：985-999.

[22]Hulin A，Moore V，James JM，et al.Loss of Axin2 results in impaired heart valve maturation and subsequent myxomatous valve disease[J].Cardiovasc Res，2017，113（1）：40-51.

（2019-06-19收稿 責任編輯：楊覺雄）