具有良好風味德氏乳桿菌保加利亞亞種的篩選及其產香性能分析

丹彤，田佳樂，喬少婷

(內蒙古農業大學，乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特，010018)

酸奶是以新鮮牛奶為原料，經乳酸菌發酵制成的一種傳統發酵乳制品[1-2]。酸奶中含有大量的活性乳酸菌，這些乳酸菌在發酵過程中可產生多種代謝產物，包括有機酸、胞外多糖、風味化合物以及人體所必需的維生素和礦物質等。這些菌體及其代謝產物具有改善酸奶風味，提高發酵乳營養價值，調節并維持腸道菌群平衡，抑制腫瘤和免疫賦活等優良功能[3-5]。

乳酸菌在牛乳發酵和貯藏過程中可產生揮發性化合物，賦予產品獨特的風味。近年來，一些國內外研究學者采用固相微萃取(solid phase micro-extraction，SPME)和GC-MS技術從發酵乳制品中檢測出多種風味化合物。如2014年，PAN等[6]采用SPME-GC-MS技術分析戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)發酵乳中的揮發性風味物質，發現乙醇、2，3-丁二酮和乙酸等化合物對產品風味的形成發揮重要作用；BELTN-BARRIENTOS等[7]利用此項技術從乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)發酵乳中鑒定了酸類、醛類、酮類、醇類等化合物。李安等[8]運用GC-MS技術對開菲爾，西藏靈菇乳以及開菲爾粒-西藏靈菇混合發酵乳中的揮發性風味化合物進行檢測，發現開菲爾粒-西藏靈菇混合發酵乳的風味明顯優于其他2組。

德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)是生產酸奶及發酵乳制品的常用菌株之一，在酸奶發酵和貯藏過程中可產生多種風味化合物[9-10]。本實驗采用SPME-GC-MS技術，以科漢森公司提供的商業發酵劑為對照組，從分離自傳統發酵乳制品中的具有良好發酵特性的德氏乳桿菌保加利亞亞種中篩選出1株具有良好風味的菌株，并在此基礎上繼續分析該菌株在牛乳發酵和貯藏過程中產生的揮發性風味化合物，為酸奶發酵劑的開發應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株來源

實驗用菌株及來源如表1所示。

表1 實驗用菌株及其來源Table 1 Experimental strains and their sources

1.2 試驗試劑

脫脂乳粉，美國New Zealand公司；全脂乳粉，美國Fonterra公司；MRS液體培養基，賽默飛世爾科技(北京)有限公司；實驗氣體：高純氦(純度>99.999%)。

1.3 儀器與設備

ZHJH-C1214C型超凈工作臺、DHP-9272型生化培養箱，上海一恒科技有限公司；SRH60-70型高壓均質機，上海申鹿均質機有限公司；7890B GC-5977A MSD型GC-MC儀、HP-5毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司；手動SPME進樣手柄、二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)萃取頭(50/30 μm)，美國Supelco公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 制備培養基

于100 g/L脫脂乳粉培養基中添加1 g/L酵母粉，滅菌(115 ℃,7 min)，制備脫脂乳培養基；按11.5∶100(g∶mL)配制成全脂乳粉培養基，均質(60 ℃,20 MPa)2次后，95 ℃滅菌10 min，急冷備用。

1.4.2 菌種活化

按照體積分數為2%的接種量，將實驗菌株接種于脫脂乳培養基中，37 ℃培養24 h，然后以同樣的接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃繼續培養 24 h，以同樣方式連續傳代培養2～3次。

1.4.3 發酵

按照5×106CFU/mL接種量把上述活化的菌株接種于全脂乳培養基中，在42 ℃下發酵，直至發酵乳pH值降至4.5，停止發酵，得到發酵乳樣品。

1.4.4 發酵乳中風味物質的檢測方法

樣品前處理：將5 mL發酵乳樣品裝入15 mL樣品瓶中，55 ℃下平衡10 min，將老化(250 ℃，5 min)后的萃取頭插入樣品瓶中萃取50 min后插入氣相色譜儀進樣口中，于250 ℃下解吸附3 min。

氣相色譜條件：起始溫度35 ℃，保持5 min；以5 ℃/min 升溫至140 ℃，保持2 min；以10 ℃/min繼續升溫至250 ℃。進樣口溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流進樣。

質譜條件：電離方式為EI源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍m/z35～500；發射電流100 μA，檢測電壓1.4 kV，無溶劑延遲。

2 結果與分析

2.1 發酵乳中風味化合物比較分析

采用SPME-GC-MS技術，以商業發酵劑為對照組，比對分析6株德氏乳桿菌保加利亞亞種在牛乳發酵終點時產生的揮發性風味化合物，結果如表2所示。酸類化合物能賦予發酵乳酸爽的口感[11-12]。Tb1-1、MGA17-6發酵乳和對照組中均檢測到乙酸，分別為6.8%、4.01%和3.68%。MGD4-2發酵乳中己酸的相對含量最高，達到9.14%，其次為Tb1-1，對照組中未檢測到己酸。乙醛是發酵乳中的重要特征風味化合物，一定濃度的乙醛可以賦予產品良好的風味，但濃度過高時會產生刺鼻氣味[13]。除MGB30-1、MGB45-5外，其他發酵乳和對照組中均檢測到乙醛。乙偶姻可賦予發酵乳濃郁的奶油香味[14]。MGB30-1、MGD4-2和Tb1-1發酵乳中均檢測到乙偶姻，其相對含量分別為7.08%、9.63%和17.4%。醇類化合物閾值較高，對發酵乳風味影響較小，但醇類化合物可使發酵乳風味更加飽滿[15]。除MGB30-1外，其余5組德氏乳桿菌保加利亞亞種發酵乳中均檢測到1-壬醇，其相對含量分別為1.8%、2.64%、3.91%、2.47%、0.49%和0.54%。甲酸乙烯酯可賦予發酵乳愉快的水果甜味[16]。MGB30-1、MGD4-2、MGA17-6發酵乳中均檢測到甲酸乙烯酯，其中MGB30-1發酵乳中甲酸乙烯酯含量最高，達到61.17%。

表2 發酵終點時發酵乳中的重要揮發性風味化合物Table 2 Some important volatile flavor compounds in the fermented milk at the end of fermentation

主成分分析(principal component analysis，PCA)是一種經典的特征抽取降維技術，通過少數幾個主分量來解釋多變量間的內部關系，并通過圖形間重疊部分的大小與距離遠近直觀反映化合物間的相似成分。本試驗通過對6株德氏乳桿菌保加利亞亞種發酵乳和對照組JD中的揮發性風味化合物在發酵終點時產生的揮發性物質成分進行PCA，結果如圖1所示。6株德氏乳桿菌保加利亞亞種發酵乳和對照組可聚為3個類群，其中MGD4-2與Tb1-1聚為一類，MGB29-2和MGB45-5聚為一類，MGB30-1、MGA17-6和對照組JD聚為一類。觀察發現，MGB30-1與對照組無重疊部分且有較小距離，MGA17-6與對照組兩者之間距離最近且有部分重疊，說明MGA17-6發酵乳中的揮發性風味化合物組成及含量與對照組相似度最高，有較好的開發利用研究價值，因此，選擇MGA17-6作為實驗菌株，進一步分析該菌株從牛乳發酵到貯藏期間產生揮發性風味化合物的動態變化規律。

2.2 發酵乳中風味化合物動態變化

MGA17-6在牛乳發酵(3、6 h)和貯藏(0、1、3、7、14 d)期間產生酸類、醛類、酮類、酯類、醇類、碳氫類、含氮類和雜環類等化合物，其中一些對發酵乳風味的形成有影響的揮發性化合物的種類和相對含量如表3所示。

表3 德氏乳桿菌保加利亞亞種MGA17-6發酵乳中揮發性風味物質的GC-MS鑒定結果Table 3 Volatile flavor compounds in fermented milk of Lactobacillus bulgaricus MGA17-6 by SPME-GC-MS

2.2.1 酸類化合物

酸類化合物一般由脂肪分解與微生物發酵產生[17]。乙酸是乳酸菌發酵產生的重要酸類化合物之一[18]，在發酵后期(6 h)和貯藏期間其相對含量分別為3.66%、4.01%、4.68%、6.09%、4.91%和7.88%。己酸可賦予發酵乳酸味、脂肪味及乳酪味[19]，試驗結果發現，己酸從發酵初期至貯藏后期相對含量分別為1.07%、2.42%、3.43%、4.25%、3.49%、1.58%、0.56%，呈先上升后下降的趨勢，于貯藏1 d時達到峰值。辛酸具有微弱水果酸味[20]，在發酵和貯藏期間其相對含量分別為0.32%、1.22%、1.80%、1.80%、2.29%、1.55%和2.04%，整體呈上升趨勢。

2.2.2 醛類化合物

醛類化合物閾值較低，對發酵乳風味的構成具有重要作用[21]。乙醛是發酵乳中的重要風味化合物。一般認為，德氏乳桿菌保加利亞亞種是生產乙醛的主要菌株，主要是因為德氏乳桿菌保加利亞亞種不含乙醛脫氫酶，可以使乙醛不被還原而在發酵乳中累積[22]。本實驗中乙醛相對含量較高，特別是在貯藏0 d時達到峰值(30.09%)。庚醛具有強烈的油脂味[23]，發酵和貯藏期間均檢測到庚醛。

2.2.3 酮類化合物

酮類化合物是由多不飽和脂肪酸經氧化或熱降解、氨基酸降解或微生物代謝所產生[24]。在鑒定的酮類化合物中，2-庚酮具有輕微的藥香氣味[25]，在發酵和貯藏期間檢測到2-庚酮的相對含量分別為26.83%、14.62%、11.99%、16.90%、11.53%、14.10%和8.35%，遠高于其他酮類化合物。此外，相對含量較高的酮類化合物還有2-壬酮，2-壬酮具有乳酪、奶香氣味[26]，在發酵(3、6 h)和貯藏(0、1、3、7 d)期間相對含量分別為10.57%、6.34%、4.37%、7.33%、5.51%和4.59%。

2.2.4 酯類化合物

酯類化合物是發酵乳中重要揮發性化合物，具有很低的香味閾值，對發酵乳風味的形成影響較大[27]。本實驗所檢測到的酯類化合物中，相對含量較高的有甲酸乙烯酯，其在發酵(3、6 h)和貯藏(0、1、3 d)期間相對含量分別達到2.68%、5.68%、7.92%、6.23%和4.63%，整體呈先上升后下降的趨勢，是發酵乳中重要的風味化合物。

2.2.5 醇類化合物

本實驗檢測到的醇類化合物主要有(S)-1，3-丁二醇、2-己氧基-乙醇、1-己醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基正乙醇等。在這些醇類化合物中，一些低分子醇在發酵和貯藏期間的相對含量較高，如1-己醇的相對含量分別為2.01%、2.56%、2.21%、2.93%、3.52%、3.22%和2.71%。

2.3 發酵和貯藏期間發酵乳中揮發性風味物質熱圖聚類分析

利用熱圖對MGA17-6在牛乳發酵和貯藏過程中產生的揮發性風味物質進行聚類分析，結果如圖2所示。根據熱圖的垂直方向，所有樣品被分為兩大類，發酵初期(3 h)、發酵后期(6 h)及貯藏初期(0、1 d)與貯藏中后期(3、7、14 d)揮發性風味化合物的種類與相對含量差異明顯，發酵初期與發酵后期風味化合物較為相似，貯藏初期、貯藏中期發酵乳中揮發性風味化合物的種類和含量相似度較高，說明牛乳在發酵和貯藏期間發酵乳的品質發生了明顯變化。香氣成分種類繁多，物質間相互作用，賦予發酵乳良好的品質[10]，如醛類物質化學性質活潑，主要通過氨基酸降解產生，多為中間體化合物，一般不能穩定存在，在后熟階段容易被還原成相應的酸類化合物和醇類化合物[28]。醇類化合物的生成與乳糖代謝、甲基酮還原、氨基酸代謝、亞油酸和亞麻酸降解有關[29]，分子質量較小的酸類物質與醇類物質發生酯化反應產生酯類化合物。

3 結論

(1)以科漢森公司提供的發酵劑為對照，采用SPME-GC-MS技術分析6株德氏乳桿菌保加利亞亞種在牛乳發酵終點(pH 4.5)時產生的風味物質，從中篩選出1株具有良好風味的菌株(MGA17-6)。

(2)MGA17-6在牛乳發酵和貯藏期間產生的主要風味化合物包括酸類、醛類、酮類、酯類、醇類等，其中一些重要的化合物如乙酸、乙醛、庚醛、乙偶姻、1-庚醇等對發酵乳的風味產生重要的影響。

(3)在發酵和貯藏期間，MGA17-6發酵乳中的揮發性風味物質的聚類分析結果表明，發酵乳中的風味物質在牛乳發酵及貯藏期間變化顯著，發酵初期(3 h)、發酵中后期(6 h)、貯藏初期(0、1 d)與貯藏中后期(3、7、14 d)差異顯著，說明發酵及貯藏期間發酵乳中的揮發性風味化合物的種類與相對含量差異明顯。