甜瓜皮多酚的提取及其對牛肉保鮮效果的影響

林娟，韓玲*，陳顥予，余群力，李維正，朱躍明，張偉，韓明山

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州， 730070)2(張掖市萬禾草畜產業科技開發公司，甘肅 張掖， 734000) 3(甘肅康美現代農牧產業集團有限公司，甘肅 臨夏， 731500)4(內蒙古科爾沁牛業股份有限公司，內蒙古 通遼， 028000)

牛肉因其具有高蛋白低脂肪、營養豐富和味道鮮美等特點，深受消費者的青睞[1]。隨著社會的發展、人們生活質量的不斷提高，對肉制品安全和品質的關注度也逐漸提高。冷鮮牛肉因其嫩度好、顏色新鮮和營養價值高而優于冷凍和冷藏牛肉[2]。但在貯藏、運輸和銷售環節中，易受到外部微生物或自身酶的影響，發生脂肪和蛋白氧化，從而導致腐敗變質[1,3]，同時氧化產生的系列產物會影響肉品的品質以及營養價值，導致色澤劣變、風味惡化、營養物質損失等[4-6]。目前，添加抗氧化劑是防止肉制品中脂肪和蛋白氧化的方法之一，但人工合成的抗氧化劑存在較多的安全隱患，對人體健康具有不利影響，甚至能致癌[7]。天然抗氧劑因其具有較高的安全性、抗氧化能力和一定的保鮮作用，越來越受到人們的青睞[8]。因此，天然抗氧化劑在肉及肉制品中的應用成為人們關注和研究的熱點。

多酚類物質是一類具有生物活性的植物次生代謝產物[9]，廣泛分布于植物的根、莖、葉、皮和果中，在自然界的儲量非常豐富[10]。研究表明，植物多酚因具有抗氧化、抗菌和抗炎等特性[11-12]，開發前景良好。這些特性能改善肉品質，并且能夠抑制肉制品中微生物的生長、延緩脂肪和蛋白氧化，從而延長其保質期[8]。甜瓜營養豐富，含有大量的可溶性糖、維生素C、氨基酸、有機酸和可溶性蛋白質等物質[13]，其果肉性寒，具有利尿、除煩熱等功效[14]。目前甜瓜主要以鮮品和甜瓜干形式銷售，其他形式的產品較為少見，而甜瓜皮和不少殘次瓜被隨意丟棄或者直接喂養牲畜，這造成很大的農產品資源浪費，既浪費資源又污染環境。植物多酚提取方法主要有超聲波輔助法、溶劑浸提法、微波提取法、超臨界CO2提取法、生物酶解提取法以及超高壓提取法等[15]。超聲波輔助法是利用超聲波的機械和空化作用從而產生振動使細胞壁破碎，有效成分短時間被釋放，減少了多酚的氧化破壞[16]。相比傳統方法，超聲波輔助法耗時短、提取率高，近年來受到廣泛應用[15]。然而，目前采用超聲波輔助法提取甜瓜皮中多酚且甜瓜皮多酚在肉及肉制品貯藏中的影響，國內外鮮有文獻報道。

本文采用超聲波輔助法提取甜瓜皮多酚，響應面法優化多酚提取工藝，選用不同濃度甜瓜皮多酚保鮮牛肉，在4 ℃條件貯藏，分別在第0、1、3、5、7、9天測定牛肉的pH、色度、揮發性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)、硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactant substances，TBARS)值并結合感官評價，探究甜瓜皮多酚對牛肉保鮮過程中品質的變化，旨在為甜瓜皮的深加工和利用、延緩和降低肉制品貯藏過程中的品質劣變提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“瑪瑙”厚皮甜瓜，甘肅省民勤縣收成鄉露地栽培大田，將瓜皮打漿破碎，于-18 ℃冰箱中保存，使用前置于4 ℃的冰箱中融解備用；牛肉，甘肅省武威市天祥肉類加工有限公司。

沒食子酸標準品、福林酚試劑，上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、乙酸乙酯、無水碳酸鈉、三氯乙酸、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、乙二胺四乙酸二鈉、2-硫代巴比妥酸，天津市光復科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TGL-24MC高速冷凍離心機，長沙英泰儀器有限公司；PHS-3C數顯酸度計，上海宇隆儀器有限公司；RE52CS型旋轉蒸發儀，上海雅榮生化儀器有限公司；CR-10型色度計，柯尼美能達有限公司；WFZ UV-2802SH型紫外可見分光光度計，上海柯儀器有限公司；K9840型自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 甜瓜皮多酚的提取

甜瓜皮多酚的提取工藝流程如下：

甜瓜皮→破碎、打漿→超聲波輔助提取→抽濾→多酚粗提液→離子沉淀純化→乙酸乙酯萃取→旋轉蒸發濃縮→多酚提取液→真空冷凍干燥→多酚粉末

1.3.2 標準曲線的繪制

用福林-酚法測定[17]。稱量20 mg沒食子酸于20 mL 容量瓶，加蒸餾水溶解并定容，配制質量濃度為1 mg/mL的沒食子酸標準液。分別吸取1、2、3、4、5 mL上述標準液于100 mL容量瓶，定容，稀釋成質量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL。各取1 mL置于10 mL具塞比色管，加入0.25 mL福林酚試劑，室溫下反應5 min 后加入15%(質量分數)Na2CO3溶液1 mL，定容，50 ℃水浴10 min，冷卻，在760 nm處測定吸光度。

1.3.3 多酚提取率的測定

取甜瓜皮多酚粗提液1.0 mL，按沒食子酸標準曲線制作的方法進行測定。平行測定3次，取平均值。通過線性回歸方程計算甜瓜皮多酚濃度，多酚提取率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：C表示多酚質量濃度，mg/mL；V表示粗提液體積mL；n表示稀釋倍數；m表示原料質量，g。

1.3.4 單因素試驗

分別考察乙醇體積分數(40%、50%、60%、70%、80%)、液料比[5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1(mL∶g),后同]、超聲時間(30、60、90、120、150 min)、超聲溫度(30、40、50、60、70 ℃)對提取率的影響。

1.3.5 響應面試驗優化

在單因素試驗的基礎上，對乙醇體積分數、液料比、超聲時間和超聲溫度設計4因素3水平試驗。

1.3.6 肉樣處理

開啟紫外線燈殺菌30 min，在無菌環境下去除脂肪和筋膜，將肉塊分割成方形，每塊大約100 g。分別用無菌水和不同濃度的多酚濃縮液浸泡約5 min，取出瀝干2～5 min后用無菌保鮮袋分裝于4 ℃冷藏條件保存，在第0、1、3、5、7、9天對各項指標進行測定。

1.3.7 指標測定

1.3.7.1 pH值

參照楊斌等[2]的方法，用便攜式酸度計測定肉樣pH值，將酸度計探頭插入到肉樣中，待酸度計讀數穩定后記錄。

1.3.7.2L*值和a*值

參照楊斌等[2]的方法，將牛肉切面自然氧合30 min，校準色差計后，垂直于牛肉切面進行測量。

1.3.7.3 揮發性鹽基氮的測定

參照GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》[18]中的半微量定氮法進行測定。

1.3.7.4 硫代巴比妥酸反應物

參照GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》[19]中的分光光度法進行測定。

1.3.7.5 感官評價

參考郝瑞等[20]的方法稍作修改進行評定，每項指標滿分為10分，具體評分標準見表1。

表1 感官評價表Table 1 Sensory evaluation table

1.4 數據統計與分析

試驗均平行3次，數據取平均值±標準偏差表示，試驗數據采用Origin 9.0軟件繪圖和SPSS 19.0對數據進行統計分析，采用單因素方差分析(ANOVA)和多重比較(Duncan法)，差異顯著水平為0.05，Design Expert 8軟件進行響應面優化處理。

2 結果與分析

2.1 單因素結果分析

圖1-a為乙醇體積分數對多酚提取率的影響，多酚提取率隨乙醇體積分數的上升逐漸增大，當乙醇體積分數為60%時，多酚提取率最高，且顯著,高于乙醇體積分數為50%的多酚提取率(P<0.05)，其原因可能是乙醇體積分數在一定的條件下，能有效促進多酚類物質的溶解[17]。繼續增大乙醇體積分數，多酚提取率變化差異不顯著，可能是因為乙醇體積分數增大，一些弱極性成分、醇溶性色素等雜質溶解，抑制了有效多酚物質的充分溶出[15]。因此，選擇乙醇體積分數為60%。

液料比對多酚提取率的影響如圖1-b所示，多酚提取率隨液料比的增加先增加后趨于平緩，可能是因為一定體積的乙醇溶劑可以促進多酚類物質的溶出，當液料比為20∶1時，多酚提取率最高，此時多酚類物質的溶解度達到飽和狀態[17]。繼續增大液料比，多酚提取率變化不顯著，可能是因為乙醇溶劑的增加使一些色素和醇溶性等雜質溶解[21]，阻止了有效成分的溶出，因此選用液料比為20∶1。

圖1-c為超聲時間對多酚提取率的影響，多酚提取率隨超聲時間的延長呈先升高后降低的趨勢。這可能是因為超聲波使細胞組織破壞，促進多酚類物質溶出，但超聲時間過短會導致多酚類物質提取不充分[17]，超聲60 min時提取率最高。繼續延長超聲時間，超聲波產生強烈的熱效應導致一些不穩定多酚被分解轉化，同時超聲時間過長會使多酚類物質被氧化分解，導致多酚提取率下降[21]，故選擇超聲時間為60 min。

2.2 響應面試驗分析

根據中心組合試驗設計原理，對乙醇體積分數(A)、液料比(B)、超聲時間(C)、超聲溫度(D)4個單因素，進行4因素3水平的試驗設計。試驗設計及結果和方差分析結果分別見表2、表3。

通過統計分析軟件Design Expert 8對表2中數據進行擬合分析，得到二次多元回歸線性方程:

Y=5.37+0.078A+0.14B-0.005C-0.091D-0.21AB+0.20AC-0.15AD+0.14BC-0.068BD+0.26CD-0.58A2-0.67B2-0.79C2-0.71D2

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

F值的大小反映因素對響應值的影響程度[21]，由F值可知，各個因素對多酚提取率的影響從弱到強依次為液料比、超聲溫度、乙醇體積分數和超聲時間。其中一次項B、二次項、交互項CD對多酚提取率的影響極顯著(P<0.01)，交互項AB、AC差異顯著(P<0.05)。

各因素對甜瓜皮多酚提取率影響的響應面曲線圖如圖2所示。主要反映了乙醇體積分數、液料比、超聲時間和超聲溫度之間的相互作用關系。響應面圖形坡度越陡峭、越傾斜，說明兩因素的交互作用越強[17]。由3D圖可知超聲溫度與超聲時間交互效應極顯著，乙醇體積分數與液料比、乙醇體積分數與超聲時間交互效應顯著。

我國農業水價整體偏低，現行水價政策在定價方面存在不合理情況，水費標準不符合經濟規律，其根據供水成本進行收費，成本中排除農業投勞折資導致的固定資產折舊，使得水費標準低于供水成本，弱化了水資源的價值。水價偏低致使人們節水意識低下，無法發揮市場的調控作用，造成水資源的大量浪費。

2.3 最優提取工藝及驗證實驗

利用響應面優化分析，得到甜瓜皮多酚提取的最優工藝為：乙醇體積分數60.61%，液料比20.51∶1，超聲時間60.02 min，超聲溫度39.25 ℃，此條件下得到的甜瓜皮多酚提取率為5.39 mg/g。但考慮實際操作范圍，將提取工藝參數調整為：乙醇體積分數61%，液料比21∶1，超聲時間60 min，超聲溫度 40 ℃。在最優工藝下平行3次驗證試驗，得到甜瓜皮多酚的平均提取率為5.31 mg/g。與理論預測值的誤差為1.5%。因此，利用響應面優化的工藝穩定，可行。

2.4 甜瓜皮多酚對貯藏期間牛肉品質的影響

2.4.1 pH

pH是評價肉類新鮮程度的重要指標之一[2]。根據GB/T 9695.5—2008，pH 5.8～6.2為一級鮮度，pH 6.3～6.6為二級鮮度，高于6.7為變質肉。從圖3可以看出，隨著貯藏時間的延長，牛肉的pH值均先下降后上升，可能是因為宰后前期動物肌肉發生糖酵解，最終產物是乳酸，導致pH值下降，隨貯藏時間的延長，在內源酶和微生物的作用下使蛋白分解產生堿性含氮物質，致使肉的pH上升[23]。對照組pH值均顯著低于處理組，且pH值隨添加量的增加升高緩慢，對照組在第9天時，pH值為6.44，多酚處理組在第9天時pH均顯著低于對照組，這說明多酚對冷卻肉具有很強的抑菌作用和保鮮效果，可以延長牛肉的保質期。

2.4.2 色度

色澤在一定程度上反映肉的感官品質，直接影響消費者的喜好[2]。不同處理組牛肉在貯藏過程中色度變化如表4所示。L*隨貯藏時間的延長呈現上升的趨勢，可能是因為隨貯藏時間的延長，蛋白質的變性程度增加，肉的保水性下降，肌肉內部的水分滲出堆積在肉的表面，提高了對光的反射能力[24]，而對照組的L*值在整個貯藏期間總體顯著高于中高濃度多酚處理組(P<0.05)，說明多酚較好地抑制了肉中水分的流失。a*值的變化與肌紅蛋白的含量和狀態關系密切[25]。對照組、處理組a*值均隨著保藏時間的延長，呈現先增加后降低的趨勢。可能是因為貯藏前期肌紅蛋白與空氣中O2反應，生成氧合肌紅蛋白，使a*不斷上升；貯藏后期肉中氧合肌紅蛋白(MbO2)逐步被氧化為高鐵肌紅蛋白(MetMb)，導致a*值下降。中高濃度處理組的a*值均顯著低于對照組，可能是因為酚類物質可與Fe2+離子絡合，從而抑制肉色的褐變[26]。

表4 貯藏期間牛肉色度的變化Table 4 Changes in color of beef during storage

2.4.3 TVB-N

TVB-N是檢驗肉品新鮮度的重要指標[27]。肉在貯藏期間由于受到微生物和酶的作用將蛋白質分解為氨以及胺類等堿性含氮物質，從而使肉腐敗變質[27]。由圖4可知，對照組和不同濃度多酚處理的冷卻肉的TVB-N含量隨貯藏時間的延長而增大，且中高濃度處理組TVB-N值顯著低于空白組。貯藏至第9天時，對照組達到26.37 mg/100g，已超過國標限定值。與之相比較的多酚處理的冷卻肉貯藏至第9天時均未超過25 mg/100g且相比對照組降低14.30%，但20和25 g/L差異不顯著。說明甜瓜皮多酚能夠能延緩冷卻肉TVB-N值的升高，延長其貨架期。

2.4.4 TBARS

TBARS表征反應中氧化產物丙二醛的質量分數，丙二醛是酯類物質氧化的一種次級代謝產物，肉及肉制品中脂肪氧化酸敗水平可用丙二醛含量反映，丙二醛含量越高，TBARS越大，表明產生較多的小分子物質如醛、酮、酸等，脂肪氧化酸敗的程度越高[28]。鮮肉TBARS為0.201～0.665 mg/kg，TBARS高于1.0 mg/kg為變質肉[29]。如圖5所示，對照組和處理組TBARS均隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢，但對照組上升幅度明顯高于中高濃度多酚處理組(P<0.05)。對照組在貯藏至第9天時達到了1.08 mg/kg，肉品發生腐敗變質，而多酚處理組TBARS均低于1.0 mg/kg，說明多酚處理能有效延緩脂肪氧化。

2.4.5 感官評價

感官是反映肉制品最直觀的指標，肉的感官特性直接影響消費者的購買欲望[30]。圖6是牛肉在貯藏期間色澤、氣味、黏度和彈性綜合得分。隨貯藏時間的延長，牛肉的綜合感官評分均呈下降的趨勢且對照組下降最快。且中高濃度多酚處理組與對照組之間差異顯著(P<0.05)，第9天時，對照組的感官已處于不可接受水平，而經過中高濃度的多酚處理的樣品在第9天感官評分顯著高于對照組，這可能是因為多酚良好的抑菌性和抗氧化性，抑制微生物的生長和延緩肉制品的氧化，從而延緩牛肉感官特性的劣變[20]。

3 結論

甜瓜皮多酚提取的最優工藝條件為：乙醇體積分數61%，液料比21∶1(mL∶g)，超聲時間60 min，超聲溫度40 ℃。通過對牛肉各個指標的檢測，結果表明，甜瓜皮多酚對牛肉有較好的保鮮效果，可有效延緩貯藏過程中的腐敗變質。當甜瓜皮多酚質量濃度為20 和25 g/L時，其保鮮效果無明顯差異。因此，甜瓜皮多酚的最佳質量濃度為20 g/L，可作為天然抗氧化劑應用于食品加工及肉制品的保鮮過程中。