柚子精油微膠囊的制備及其對鮮切蘋果保鮮效果的研究

杜津，何悅，劉敏，曹思源，徐丹,2*，任丹,2

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400700)2(西南大學 食品貯藏與物流研究中心，重慶，400700)

植物精油是指從植物的花、葉、莖、根或果實中提取的揮發性芳香物質，具有消炎、抗菌和鎮靜等作用。從可食性植物中提取的精油，其成分安全可食，可用作綠色保鮮劑以替代化學防腐劑，在食品保鮮中具有廣闊的應用前景，目前常用的有牛至精油[1]、百里香精油[2]、生姜精油[3]、紫蘇精油[4]等。但是精油易揮發、易氧化、疏水性強，且具有特殊的味道，極大地限制了其應用。近年的研究表明，采用微膠囊技術將精油進行包封后，一方面可有效地防止其氧化變質，另一方面可達到緩釋的目的以延長其作用時間，因此可大大推動精油作為綠色食品保鮮劑的實際應用。

微膠囊技術是指將某一目的物(芯材)用高分子化合物形成的連續薄膜(壁材)完全包覆起來，然后通過外部刺激或緩釋作用在一定環境或條件下，將目的物釋放出來而發揮其功能。近年來，采用安全無毒的天然高分子作為壁材來包裹可食性功能成分制備微膠囊體系，已成為食品領域的研究熱點之一。一方面，包封不穩定和生物利用度低的營養物質，可提高其穩定性和利用度，或實現體內的靶向輸送[5]；另一方面，將天然抗氧化和抗菌成分如精油等作為芯材進行包封后，可將其作為長效緩釋的保鮮劑用于食品保鮮[6]。以精油為芯材制備微膠囊的方法有分子包埋法、相分離法、噴霧干燥法、溶劑揮發法等[7-10]。其中，以明膠(gelatin，GE)和阿拉伯膠(gum arabic，GA)作為壁材的反應條件溫和，制備工藝簡單[11-12]，并可采用谷氨酰胺轉氨(glutamine transaminase，TG)酶作為壁材交聯劑，以替代有毒的甲醛和戊二醛[13]。

柑橘精油主要存在于柑橘果皮或枝葉組織的油胞中，主要由單萜和倍半萜烯碳氫化合物及其含氧衍生物等組成，以檸檬烯含量最為豐富[14-15]。柚子精油(pomelo essential oil,PEO)是柑橘精油的一種，提取于柚子外果皮，具有較好的抗氧化和抗菌效果[16-17]。研究表明，柚子精油對冷鮮肉和蘋果等均具有較好的保鮮效果[18-19]。為了防止柚子精油氧化并延長其作用時間，本研究以明膠和阿拉伯膠為壁材，采用TG酶作為交聯劑，通過復凝聚法制備柚子精油微膠囊，對其制備工藝進行優化，并對微膠囊的結構和性能進行了表征；在此基礎上，考察了精油微膠囊對鮮切蘋果貯藏品質的影響，對其保鮮效果進行了驗證和評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柚子精油，純度為99%，江西吉安中南香料廠；TG酶、木瓜蛋白酶，純度為70%，泰興市東勝食品科技有限公司；新鮮甘肅富士蘋果，重慶本地超市；聚丙烯餐盒(16.8 cm×11.5 cm×4.5 cm)，石家莊創美紙制品有限公司；GE、GA，均為分析純，上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、草酸、鹽酸，均為化學純，川東化工有限公司；福林酚、碳酸鈉、甲醇、無水乙醇、正己烷、冰醋酸，均為化學純，成都市科龍化工試劑廠；2，6-二氯酚靛酚鈉鹽、沒食子酸，分析純，重慶市鈦新化工有限公司。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計(SP-756P)，上海光譜儀器有限公司；氣質聯用儀(GC-MS-QP2010 Ultra)，日本島津公司；掃描電子顯微鏡(Phenom Pro)，荷蘭Phenom World公司；熒光正置顯微鏡(BX53)，日本OLYMPUS公司；差示掃描量熱儀(DSC 4000)，美國PerkinElmer公司；熱重分析儀(SDT Q600)，美國TA公司；紅外光譜儀(Spectrum100)，美國PerkinElmer公司；阿貝折光儀(WAY)，深圳君達時代儀器有限公司；多功能酶標儀(Synergy H1)，美國BioTek儀器有限公司，色差儀(UltraScan PRO)，美國亨利特聯合實驗室有限公司；果實硬度計(GY-4)，樂清市艾德堡儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柚子精油的成分分析與抗氧化性能測試

采用GC-MS測定柚子精油的成分，測定條件為：色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；進樣口溫度320 ℃，進樣量0.4 μL，分流比20∶1；程序升溫：60 ℃保持4 min后以20 ℃/min的升溫速率升至300 ℃，保持30 min。質譜條件：EI模式(70 eV)，m/z范圍為10～1 000。

DPPH自由基清除率測定：配制濃度為0.05 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液，裝入棕色瓶備用。配制質量濃度為4～20 mg/mL的柚子精油無水乙醇溶液，分別量取等體積不同濃度的精油溶液和DPPH溶液混合后，充分搖勻后避光靜置30 min，以乙醇為參比調零，于波長517 nm下測吸光度值，標記為AS。然后，分別量取等體積的無水乙醇和DPPH溶液，精油溶液和無水乙醇，混合后進行相同操作，測定得到吸光度AC和AB。同時，將二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)配制成和柚子精油相同濃度梯度的溶液，并進行上述相同操作測定其吸光度，作為陽性對照。按照公式(1)分別計算不同濃度的柚子精油和BHT對DPPH自由基的清除率:

(1)

1.3.2 精油微膠囊的制備和工藝優化

參照文獻中的方法[7, 9]，適當修改后進行微膠囊的制備與優化。根據所需壁材添加量，稱取等量的GE、GA分別溶解于100 mL蒸餾水，在50 ℃水浴中攪拌30 min。將2種溶液混合后繼續攪拌30 min，將溫度降至40 ℃后，稱取一定量的柚子精油加入上述溶液中，以15 000 r/min的速度高速分散3 min，然后置于40 ℃水浴中攪拌。在15 min內向溶液中滴加10%(體積分數)冰醋酸溶液調節pH至一定值，反應15 min后停止加熱，自然冷卻至室溫后再用冰浴降溫至10 ℃以下。然后，在15 min內滴加1 mol/L的NaOH溶液，將溶液的pH調節至6，再加入0.25 g的TG酶，低溫攪拌固化3 h得到微膠囊懸浮液。最后，抽濾收集微膠囊并用無水乙醇洗滌至少3次，真空凍干后密封，置于干燥皿中待用。

選取溶液pH值、芯材添加量和壁材添加量進行單因素實驗。實驗設計如下：(1)采用10%(體積分數)冰醋酸將壁材和芯材混合溶液的pH值分別調節為3.5、3.7、3.9、4.1和4.3，壁材添加量為1%(質量分數)，芯材添加量為0.5%(體積分數)；(2)芯材添加量分別為0.5%、0.625%、0.75%、0.875%和1%(體積分數)，pH=3.9，壁材質添加量為1%(質量分數)；(3)壁材添加量分別為0.5%、0.75%、1%、1.25%和1.5%(均為質量分數)，pH=3.9，芯材添加量為0.5%(體積分數)。分別測定上述條件下制備的精油微膠囊的包封率和粒徑。

1.3.2.1 微膠囊包封率的測定

參照LI等[7]的方法，并進行適當修改。首先將柚子精油用正己烷稀釋至不同質量濃度溶液，于273 nm處測定吸光度值制作標準曲線。稱量0.05 g凍干微膠囊，依次加入4 mL超純水、5 mL正己烷和0.05 g木瓜蛋白酶，漩渦混合均勻，150 W水浴超聲處理180 min使微膠囊壁材溶解并提高萃取效果。然后，在4 ℃下以4 500 r/min的速度離心20 min，取上清液測定其在273 nm處的吸光度，通過標準曲線計算出上清液中的精油濃度。按照公式(2)計算得到包封率：

(2)

式中：n表示上清液中的精油質量濃度，g/mL；V表示上清液的體積；m表示制備0.05 g凍干微膠囊所添加的精油總質量，g。

1.3.2.2 微膠囊粒徑的測定

參照XIAO等[9]方法，并進行適當修改。取少量微膠囊懸浮液，均勻涂覆于載玻片上，采用正置顯微鏡觀測拍照，并對照標尺測量單個微膠囊的直徑，統計視野內所有微膠囊的粒徑和數目，求出其平均粒徑，統計數目不少于200個。

1.3.3 柚子精油微膠囊的性能表征

采用單因素優化后的最佳工藝配比(pH=3.9、芯材添加量為0.5%、壁材添加量為1%)制備微膠囊，并進行以下結構和性能的表征。

傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)測定：將GE、GA和凍干后的微膠囊均直接與KBr混合壓片后測定，純柚子精油則涂抹于空白的KBr壓片上進行測定。測試時采用的分辨率為4 cm-1，掃描32次，范圍為4 000～400 cm-1。

熱重分析(thermal gravimetric analyzer，TGA)：稱取不超過10 mg的樣品進行測定，升溫速率10 ℃/min，載氣為N2，流速為25 mL/min。

差示掃描量熱分析(differential scanning calorimetry，DSC)：稱量約4 mg樣品于鋁坩堝中，加蓋壓片后測定。溫度以20 ℃/min的速度從20 ℃升至250 ℃，保護氣體為N2，流速為20 mL/min，以空鋁坩堝為參比。

微膠囊形貌測定：取少量微膠囊懸浮液，均勻涂覆于載玻片上，采用正置顯微鏡觀測，放大倍數200倍(物鏡×4，電子目鏡×20)；凍干微膠囊噴金后用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察，放大倍數1 000倍，加速電壓為10 kV。

1.3.4 精油微膠囊對鮮切蘋果的保鮮效果測定

1.3.4.1 蘋果保鮮處理

將本地超市購買的蘋果挑選清洗后，去核均勻切分并隨機分為5組，第1組不做任何處理，作為對照，記為CK；第2組用精油溶液浸泡3 min后撈起瀝干，記為E0，精油溶液通過將5 mL精油與1 L超純水均質混合得到；另外3組分別用精油微膠囊懸浮液浸泡3、5、7 min后撈起瀝干，分別記為EM-1、EM-2、EM-3，精油微膠囊懸浮液的制作方法同1.3.2，采用單因素優化后的最佳工藝配比制備1 L的精油微膠囊溶液，加入的精油總量為5 mL。將以上各組鮮切蘋果平鋪放置于帶蓋的聚丙烯保鮮盒中，每組8盒，每盒約140 g，貯藏在溫度為4 ℃，濕度為33.3%的恒溫恒濕箱中，每2 d取樣對各組樣品的品質指標進行測定。

1.3.4.2 鮮切蘋果的品質測定

采用色差儀測定鮮切蘋果的L、a、b值，按照公式(3)計算褐變指數(browning index,BI)[20]:

(3)

采用果實硬度計測定鮮切蘋果的硬度，探針直徑4 mm，插入深度1 cm。每組測定至少3個樣品，每個樣品均勻選取3個點進行測定。

參照余易琳等[21]的方法測定鮮切蘋果中抗壞血酸的含量，結果以mg/100g表示。

參照TAHIR等[22]方法測定鮮切蘋果中總酚的含量，結果以μg/g表示。

由6位經培訓后的專業人員每天從各組鮮切蘋果中隨機選取樣品進行感官測評。每位人員在進行各組評估之前，需吃一口無糖餅干，喝一口礦泉水，以消除味覺干擾。鮮切蘋果的評價指標分別為顏色、外觀、質地、氣味、口味和整體可接受度。各評價指標的評分標準見表1，整體可接受度低于5代表失去商品性。

表1 鮮切蘋果的感官品質評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of fresh-cut apple

1.4 數據處理

除特別指出外，以上各項實驗各組樣品均重復測試至少3次，數據均采用平均值±均方差表示，并采用單因素ANOVA進行分析，用Duncan法進行多重比較，顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 柚子精油的組成與抗氧化性能

采用GC-MS檢測出了柚子精油中含有至少39種物質，其中D-檸檬烯相對含量最高為21.87%，其次為乙酸芳樟酯(21.09%)、D-西爾維烯(8.37%)、左旋β-蒎烯(7.14%)和萜品烯(3.39%)等。D-檸檬烯是單環單萜，廣泛存在于水果(尤其是柑橘)皮中，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等生物活性[23]。

圖1所示為精油和相同質量濃度的BHT對DPPH自由基的清除率。由圖1可看出，BHT具有很強的自由基清除能力，質量濃度為4 mg/mL時其自由基清除率可達94.4%，因此繼續增加其質量濃度對清除率無顯著影響。而柚子精油對自由基的清除率則隨其質量濃度的增加顯著上升(P< 0.05)。當質量濃度由4 mg/mL增加至20 mg/mL時，柚子精油對DPPH自由基的清除率由10%增加至35.9%。由此說明，柚子精油對DPPH自由基的清除能力雖然低于BHT，但在一定濃度范圍內可通過提高其質量濃度來增強其抗氧化能力。

2.2 精油微膠囊制備工藝的優化

圖2所示為精油微膠囊制備過程中的壁材和芯材混合溶液pH值、芯材添加量和壁材添加量對微膠囊包封率和平均粒徑的影響。由圖2-a可看出，微膠囊的包封率和粒徑均隨pH值的增大呈先上升后下降的趨勢。當pH值為3.7～3.9時，微膠囊的包封率達到最大值45.5%，但pH值為3.9時微膠囊的粒徑較小，為138.2 μm。當pH值超過3.9后，雖然平均粒徑顯著減小，但包封率顯著下降(P<0.05)。這可能是由于pH值升高，與明膠的等電點接近時，GE所帶正電荷減少，與GA之間的相互作用減弱，導致壁材的包封能力降低[9]。同時，pH值較高時制得的微囊壁材較薄，凍干后易破損。因此，壁材和芯材混合溶液的pH值應控制為3.9。

如圖2-b所示，當芯材即精油的添加量為0.5%(體積分數)時，微膠囊包封率為45.3%，此后則隨著芯材添加量的增加而降低。這可能是由于精油過量后，容易聚集成液滴懸浮在溶液中或被吸附于微膠囊表面，不易被包封[9]。而微膠囊的粒徑則隨著芯材添加量的增加呈波動狀態，且芯材添加量過高會導致粒徑分布范圍增大。因此，為了提高包封率，減少浪費，芯材添加量為0.5%(體積分數)為宜。

由圖2-c可看出，隨壁材添加量增加，包封率呈現先上升后下降的趨勢，至1%達到最大值，為45.3%；平均粒徑則隨壁材添加量的增加而降低。當壁材添加量超過1%時，溶液黏度增大，制備的微膠囊形狀不規則，且易分散，因此壁材添加量為1%為宜。

綜合以上實驗結果，精油微膠囊的最佳制備工藝選擇為：pH值為3.9，芯材添加量為0.5%(體積分數)，壁材添加量為1%(質量分數)。后續表征和用于鮮切蘋果保鮮的微膠囊懸浮液均為在此條件下制備得到。

2.3 微膠囊的性能表征

2.3.1 FTIR譜圖分析

2.3.2 TGA

圖4所示為精油微膠囊、空白微膠囊及其原料的熱重曲線。其中，柚子精油由于富含揮發性成分，在104.4 ℃時分解最快，200 ℃時質量損失已達96.12%。GE、GA及空白微膠囊則在310 ℃附近達最大分解速度，但空白微膠囊在600 ℃時的殘留質量高于純的GE、GA，可能是由于兩者的相互作用增強了空白微膠囊的熱穩定性。包封精油后的微膠囊其熱重曲線與空白微膠囊較為接近，但600 ℃時的殘留物質量顯著降低，可能是由壁材分解后其內包封的精油迅速揮發所致。

2.3.3 DSC分析

精油微膠囊、空白微膠囊及其原料的差示掃描量熱曲線如圖5所示。從中可看出，GA在60 ℃和123 ℃附近出現了較寬的吸熱峰，可能分別由自由水和結合水的揮發所致[24]；GE在110～120 ℃，150～160 ℃，以及170～180 ℃分別出現了吸熱峰，除了歸因于自由水、結晶水的蒸發外，也可能是由GE分子間氫鍵作用的變化所導致[25-26]。空白微膠囊出現了和GA類似的2個峰，但出峰位置向右發生偏移，說明GA和GE的相互作用使兩者的結構發生了變化[24,27]。精油微膠囊只在122 ℃出現了1個吸熱峰，說明精油的包封減少了壁材中的水分含量，且該溫度略高于純精油最大吸熱峰出現的溫度(120.3 ℃)，說明精油被包封后可減緩精油的揮發。

2.3.4 微膠囊的形貌分析

如圖6所示，凍干前的空白微膠囊具有規則的球形結構，分散較均勻；精油微膠囊具類似的球形結構，但內部有芯材填充。凍干后，空白微膠囊由于內部失水，壁材塌陷而形成褶皺；而凍干后的精油微膠囊保持了較為平滑完整的結構，說明在凍干過程中，壁材可較好地保護內部的柚子精油，從而保持微膠囊的球形結構。

2.4 柚子精油微膠囊對鮮切蘋果的保鮮效果

鮮切蘋果在貯藏期間的褐變程度用BI指數表示，其數值越大表明褐變程度越嚴重[20]。由圖7-a可看出，在整個貯藏期間，各組果實的BI指數均呈上升趨勢，但CK組的上升速度顯著高于其余組。至第14天時，CK組的BI指數已經超過130，比最低值的EM-1組高出49%。各處理組中，E0、EM-2和EM-3的BI指數幾乎無顯著差異，EM-1組的褐變程度則顯著低于其他組(P< 0.05)。這可能是由于E0組中精油揮發過快，而EM-2和EM-3浸泡時間過長，會增加蘋果的損傷，因此采用精油微膠囊浸泡3 min對蘋果的褐變抑制效果最好。柚子精油中含有的醛類、醇類等化合物可在一定條件下轉化為醇類，具有抑制多酚氧化酶活性的作用，從而可延緩鮮切水果的褐變[28]。

圖7-b顯示，鮮切蘋果的硬度隨著貯藏時間的延長而下降，且EM-2和EM-3組的硬度顯著低于其他3組(P< 0.05)，可能是這2組的浸泡時間過長，造成鮮切蘋果中水分過高，細胞組織軟化導致硬度下降。E0組和EM-1組浸泡時間較短，在前10 d與對照組無顯著性差異，但在貯藏14 d時EM-1組的硬度顯著高于其他組(P< 0.05)，說明精油微膠囊短時浸泡可較好地保持鮮切蘋果的硬度。

抗環血酸是果蔬的基本營養物質，因此其含量是衡量水果營養價值的重要指標之一[29]。如圖7-c所示，各組果實的抗環血酸含量均隨貯藏時間的延長而波動變化，在第6～10天為最低值，隨后上升再下降。且在貯藏前10 d，EM-1組抗環血酸含量相對較高，之后與其他組無顯著性差異，說明精油微膠囊在貯藏的前10 d均可較好地發揮抗氧化功能，以維持較高鮮切蘋果中較高的抗環血酸含量。

酚類化合物在蘋果中的含量較高，且與果實的總抗氧化能力密切相關[30]。如圖7-d所示，從第2天開始，各組的總酚含量幾乎均呈先上升后下降的趨勢，且在前8 d，EM-1組的上升速度顯著高于其他組，后期各組無顯著性差異。在整個貯藏期間，E0和EM-2組的總酚含量與對照組幾乎無顯著性差異，EM-3組則呈現較低的含量。由此說明，采用精油微膠囊溶液浸泡3 min可較好地維持鮮切蘋果的總酚含量，浸泡時間過長反而有不利影響。

圖8為貯藏至第2天和第8天時，鮮切蘋果各項指標的感官評分以及外觀圖片。由圖8可看出，第2天時，對照組已經發生了明顯的褐變，但口味和氣味的評分較高。E0組由于精油本身味道的影響，在口味、氣味和整體可接受度方面得分均較低。而精油微膠囊處理組則較好地降低了精油味道對鮮切蘋果的影響，并且能夠提升樣品的外觀和質地，整體接受度均優于E0組。到第8天，各組樣品的感官評分均有明顯下降。對照組雖然在口味和氣味方面仍占據優勢，但由于褐變嚴重，質地變軟，整體可接受度的評分較低。E0組的各項指標評分均為最差，整體可接受度的評分已經低至5，即將失去其商品價值。而精油微膠囊處理組中，EM-1組的口味和氣味評分略低于對照組，但質地、顏色和整體可接受度的評分均為最高，較對照組有明顯提升。從鮮切蘋果的外觀圖片也可看出，EM-1組能夠較好地抑制鮮切蘋果的褐變，更容易被消費者所接受。由此說明，直接用精油對鮮切蘋果進行處理，不但不能起到護色和保鮮的目的，反而會因為精油本身的味道對樣品的商品性造成不良影響。將精油采用微膠囊包埋后，對鮮切蘋果進行短時浸泡處理，則可較好地防止褐變并提升質地，從而提高其整體可接受度。

以上結果表明，將鮮切蘋果用精油微膠囊溶液浸泡3 min，可較好地抑制其在貯藏期間的褐變，保持其硬度，維持較高的抗環血酸和總酚含量，并能改善其感官品質，提高商品性，從而顯著提高其貯藏品質。由此說明，精油微膠囊附著在鮮切蘋果表面，可在貯藏期間持續釋放精油，以達到抗氧化和保鮮的作用。采用相同濃度的精油溶液浸泡或者延長浸泡時間，則效果不顯著甚至比對照組更差。這可能是由于純精油附著在鮮切蘋果表面后便很快揮發，無法起到持續保鮮的效果，而浸泡時間過長，則會對果實組織結構造成損傷。

3 結論

本研究以明膠和阿拉伯膠作為壁材，采用復凝聚法對柚子精油進行包埋，制備了精油微膠囊。通過單因素實驗確定了微膠囊的最佳制備工藝為：pH值為3.9，芯材添加量為0.5%(體積分數)，壁材添加量為1%(質量分數)。此時，微膠囊的包封率達45.3%，平均粒徑為138.2 μm。對在此條件下制備的微膠囊進行表征發現，明膠和阿拉伯膠通過靜電相互作用發生復凝聚，對柚子精油進行包封，且包封后其熱穩定性得到改善。形貌分析結果表明，微膠囊凍干前具有規則的球形結構，凍干后也能較好地保持其形貌。將鮮切蘋果用精油微膠囊懸浮液浸泡3 min，可較好地抑制其褐變，延緩硬度的下降，能維持較高的抗環血酸和總酚含量，并且受精油氣味影響較小，消費者接受程度較高。因此，本研究所制備的精油微膠囊能較好地提高果蔬的貯藏品質，有望作為綠色保鮮劑應用于果蔬等農產品的貯藏。