參麥注射液治療膝關節骨關節炎的網絡藥理學分析及臨床對照驗證

程中午 王大玉 張本結 周杰 杜輝

膝關節骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA) 是一種年齡相關性退行性疾病，以關節軟骨退變和滑膜炎癥為特征[1]，表現為膝關節疼痛、僵硬和功能障礙及慢性骨關節炎導致骨贅形成、關節間隙變形和狹窄[2]，其降低患者生活質量，增加社會經濟和醫療負擔。雖然 KOA 機制尚不清楚，但已知與年齡、肥胖、創傷、炎癥、遺傳易感性等機械和生物學因素對軟骨細胞內分解代謝和合成代謝有關[3-4]。早期 KOA 一般采取保守治療，主要有非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs) 和氨基葡萄糖類口服藥，以及透明質酸鈉注射液和富血小板血漿等關節腔內注射療法[5-6]。參麥注射液(shenmai injection，SMI) 關節腔內注射治療 KOA 可以改善膝關節功能，減輕關節疼痛[8]。然而，其治療 KOA 的潛在藥理作用機制尚不清楚，其成分及關鍵靶點的藥效學特性也不清楚。

網絡藥理學將化學信息學、生物信息學和網絡生物學相結合，能夠揭示復雜的藥理機制。因此，本研究將網絡藥理學與臨床對照試驗相結合，以闡明 SMI 關節腔內注射治療 KOA 的物質基礎及分子 機制。

材料與方法

一、網絡藥理學方法

1.SMI 化學成分篩選及作用靶標篩選：通過 TCMSP 數據庫檢索獲取紅參化學成分和靶點，過濾標準：口服生物利用度(oral bioavailability，OB) ≥ 30%、藥物相似性(drug-likeness，DL) ≥ 0.18。通過 BATMAN-TCM 數據庫獲取麥冬化學成分和靶點，通過設置P< 0.05，潛在分數截斷值 30。共獲得 18 個化學成分，147 個靶點。其中紅參 4 個化學成分，靶點 24 個；麥冬 14 個化學成分；靶點 123 個。去除重復靶標后獲得 106 個靶點。

2.KOA 相關靶基因搜集及篩選：從 GeneCard、OMIN 數據庫檢索 KOA 相關靶基因。去除假陽性靶基因和重復靶基因后共獲得 2064 個靶基因。將 106 個 SMI 靶點映射到 2064 個 KOA 靶基因中，得到 25 個 SMI 抗 KOA 關鍵靶點。根據 25 個關鍵靶點得出紅參治療 KOA 中有 2 個有效化學成分，麥冬治療 KOA 中有 5 個有效化學成分。

3.蛋白相互作用(protein-protein interaction， PPI) 網絡的構建與分析：將 25 個關鍵靶點導入 String 數據庫中并構建 PPI 網絡[9]。

4.拓撲分析與復合目標網絡構建：在 PPI 網絡中導出 TSV 數據，使用 Cytoscape 軟件和 CytoNCA 軟件進行分析。通過 Betweenness(BC)、Closeness(CC)、Degree(DC)、Eigenvector、Local Average Connectivity(LAC) 和 Network(NC) 對復合目標網絡進行拓撲分析，過濾關鍵靶點，獲取核心關鍵靶點。過濾條件設置為同時滿足 BC、CC、DC、EC、LAC 和 NC 的中位值。

Cytoscape 軟件能將藥物治療疾病的有效化學成分及作用機制進行可視化分析[10]。將 7 個有效活性成分及 25 個關鍵靶點導入 Cytoscape 軟件構建 SMI-關鍵靶點-KOA 復合目標網絡并實現可視化。在復合目標網絡中，其節點表示化合物、疾病或靶蛋白，其中邊表示節點分子之間得相互關系。

5.基因本體論(gene ontology，GO) 生物功能分析和基因及基因組的京都百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 通路富集分析：對 25 個關鍵靶點進行 GO 生物功能分析及 KEGG 通路富集分析。閾值設定為P≤ 0.05，并繪制柱狀圖。

6.分子對接技術分析：在 PubChem 數據庫中下載小分子配體 2D 結構文件，采用 Chem 3D 軟件進行最小自由能設置并轉化為 3D 結構文件。從 RCSB PBD 數據庫中下載基因的 PBD 格式，采用 AutoDockTools-1.5.6 加氫處理，將活性口袋設置 為 1，尋找核心靶基因活性位點或初步確定坐標。采用 AutoDock Vina 進行分子對接。利用 PyMOL 軟件繪制分子對接圖。

二、臨床對照試驗

1.一般資料與方法：選取 2017年5月至 2019年11月在我院治療的 KOA 患者。納入標準：( 1) 符合 KOA 診斷標準[11]；( 2) 癥狀性 KOA，存在日常生活活動困難，100 分的疼痛視覺模擬評分(visual analogue scale，VAS) ≥ 40 分；( 3) 影像學分級 Ⅱ～Ⅳ 級骨關節炎；( 4) 無硫酸氨基葡萄糖、SMI 過敏史；( 5) 簽署知情同意書，自愿參加研究項目，愿意接受隨訪者。排除標準：( 1) 6 個月內無膝關節創傷或手術史；( 2) 6 個月內，關節鏡檢查或膝關節開放手術、關節內注射透明質酸及類固醇，2 周內服用全身類固醇；( 3) 其它膝關節疾病如感染性關節炎、髕骨軟骨病、風濕性關節炎或類風濕因子陽性等；( 4) 計劃或預期 1 年內進行膝關節手術治療；計劃進行注射的膝關節皮膚損傷、開放性傷口；( 5) 精神類藥物或酒精依賴史；( 6) 血小板 < 100×109/ L；( 7) 妊娠及母乳喂養；( 8) 精神障礙或嚴重疾病及并發癥，如不可控制的糖尿病、高血壓或嚴重肝腎疾病等。最終納入 120例 KOA 患者。根據隨機數字表法分為觀察組(n= 65) 及對照組(n= 65)。兩組患者臨床資料比較差異無統計學意義(P> 0.05)(表1)。本研究患者均簽署知情同意書且獲得醫院倫理委員會批準通過。

表1 兩組患者臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between the two groups

2.方法：如果患者雙膝均存在 KOA，依據較嚴重一側進行治療。觀察組：SMI 膝關節腔內注射治療。由 1 名高年資醫師在超聲引導下進行膝關節腔內注射。取 SMI 4 ml 和 2% 利多卡因注射液 1 ml 混合液，采用 10 ml 針頭，在無菌條件下膝關節外側經髕上入路緩慢注射。在注射過程中，患者膝關節保持在約 20° 的輕微彎曲位置。每次 5 ml，1 次 / 周，連續治療 6 周為 1 個療程。療程結束后 6 個月進行第 2 個療程。對照組：透明質酸鈉注射液膝關節腔內注射治療與觀察組注射操作過程一致，2 ml / 次，1 次 / 周，連續治療 6 周為 1 個療程。療程結束后 6 個月進行第 2 個治療療程。注射后，要求患者限制使用患側膝關節至少 24 h，并對患處使用冷療法或冰敷以減輕疼痛。治療后禁止使用非甾體類藥物，允許研究期間患者口服對乙酰胺基酚(撲熱息痛，最大 3 g / 天)。在允許情況下，可以逐步恢復正常體育或娛樂活動。

3.數據收集及療效評估：收集注射前患者的年齡、性別、體質量指數(body mass index，BMI)、患側膝關節疼痛時間(以注射部位為準)、折射部位、影像學檢查分級、VAS 評分、McMaster 大學骨關節炎指數(the western ontario and McMaster universities，WOMAC)、健康調查簡表(the MOS item short from health survey，SF-36)。采用 WOMAC、SF-36 評估兩組患者治療后 6 周、12 周、6 個月及 12 個月后效果及生活質量。其中，治療后 6 個月的 WOMAC、SF-36 數據收集時在即將進行第 2 個治療療程前。WOMAC 是根據患者相關癥狀及體征評估其關節炎嚴重程度及其治療療效，該量表分為疼痛(5 個項目)、僵硬(2 個項目) 及關節功能(17 個項目)[12]，分數越高表示相關癥狀及體征越嚴重。SF-36[13]有 36 項評估條目，共 8 個評價項目，分為兩個維度：軀體健康(生理功能 + 軀體疼痛 + 總健康狀況) 及精神健康(活力 + 社會功能 + 情感職能 + 精神健康)。每個項目滿分 100 分，維度分數為 4 個項目得分總和的均值，分數越高表示生活質量越好。

三、統計學處理

采用 SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計數資料用百分率(%) 表示，組間比較采用χ2檢驗。計量資料以x-±s表示，采用獨立樣本t檢驗。P< 0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、25 個關鍵靶點 PPI 構建與拓撲分析

將 106 個 SMI 靶點映射到 2064 個 KOA 靶基因中，得到 25 個 SMI 抗 KOA 關鍵靶點。根據 BC > 2.833、CC > 0.247、DC > 4、EC > 0.125、LAC > 1.333 和 NC > 2.083 對 25 個關鍵靶點拓撲分析，得到胱天蛋白酶 1(caspase 1，CASP1)、CASP3、CASP8、CASP9、核因子-κB 抑制因子 α(nuclear factor-κB inhibitor α，NFKBIA)、雌激素受體 1(estrogen receptor 1，ESR1)、過氧化氫酶(catalase，CAT) 核心關鍵靶點。

二、構建 25 個關鍵靶點復合目標網絡

麥冬中麥冬酮 A(ophiopogonanone A)、鳥苷(guanosine)、豆甾醇(stigmasterol)、麥冬 A(ophiopogon A) 及尿苷(uridine)。紅參中 β-谷固醇(beta-sitosterol)、人參皂苷 rh2(ginsenoside rh2) 是復合目標網絡中主要有效化學成分。其中，β-谷固醇是調控關鍵靶點最多的有效化學成分(圖 1)。

圖1 SMI-關鍵靶點-KOA 復合目標網絡圖圖2 GO 生物功能和 KEGG 通路富集分析柱形圖 a：GO 生物功能分析柱形圖；b：KEGG 通路富集分析柱形圖Fig.1 SMI-key target-KOA composite target network diagramFig.2 Go biological function and KEGG pathway enrichment analysis histogram a: Go column chart of biological function analysis; b: KEGG pathway enrichment analysis histogram

三、GO 生物功能和 KEGG 通路富集分析

對 25 個關鍵靶點進行 GO 生物功能分析，包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF) 及細胞組成(cell composition，CC)(圖 2a)。BP 主要涉及對脂多糖反應、對細菌來源分子反應、對抗生素反應等；MF 主要涉及半胱氨酸型內肽酶活性參與細胞凋亡過程、半胱氨酸型內肽酶活性、半胱氨酸型肽酶活性等；CC 主要涉及分子功能線粒體外膜、細胞器外膜、外膜等。KEGG 富集分析結果見圖 2b，其中細胞凋亡(apoptosis) 富集程度最高。

四、核心關鍵靶點與對應有效化學成分的分子對接

選擇 CASP1、CASP3、CASP8、CASP9、NFKBIA、ESR1、CAT 核心關鍵靶點，找到對應有效化學成分進行分子對接，以結合能判斷其親和力，結合能為負值說明受體與配體具有親和力，< -5.0 kcal / mol 說明親和力較好[14]。對接結果見圖 3 及表 2，可見 CASP1、CASP3、CASP9、NFKBIA、ESR1、CAT 與 SMI 有效活性成分結合能均 < -5.0 kcal / mol，至少存在 1 個氫鍵，說明核心關鍵靶點與 SMI 有效化學成分具有較好親和力，其中 stigmasterol 對接 CAT 存在 4 個氫鍵。

圖3 核心關鍵靶點與對應有效化學成分的分子對接圖 a～e：Beta-sitosterol 對接 CASP1 / CASP / CASP8 / CASP9；f～g：Stigmasterol 對接 ESR1 / CAT；人參皂苷 rh2 對接 NFKBIAFig.3 Molecular docking map of core key targets and corresponding effective chemical components a - e: Beta-sitosterol docked CASP1 / CASP / CASP8 / CASP9; f - g: Stigmasterol docked ESR1 / CAT; ginsenoside rh2 docked NFKBIA

表2 核心關鍵靶點與對應有效化學成分的分子對接結果Tab.2 Docking results of core key targets with corresponding effective chemical components

五、兩組患者 WOMAC、SF-36 比較

觀察組中 3例未按時完成 SMI 腔內注射， 1例隨訪丟失；對照組中 1例未按時完成透明質酸鈉注射液腔內注射，1例隨訪丟失。治療后 6 周、12 周、6 個月、12 個月，觀察組 WOMAC 中疼痛、僵硬、功能評分低于對照組(P< 0.05)；觀察組 SF-36 中軀體健康評分高于對照組(P< 0.05)(表3)。

表3 兩組患者術后 WOMAC 和 SF-36 比較 (±s)Tab.3 Comparison of WOMAC and SF-36 between the two groups(±s)

表3 兩組患者術后 WOMAC 和 SF-36 比較 (±s)Tab.3 Comparison of WOMAC and SF-36 between the two groups(±s)

變量 觀察組(n = 61) 對照組(n = 63) t 值 P 值WOMAC 疼痛 6 周 10.45±2.38 12.91±2.41 5.717 0.000 12 周 6.28±2.05 10.26±2.12 10.621 0.000 6 個月 7.28±2.15 11.72±2.27 11.182 0.000 12 個月 6.14±2.11 10.12±2.24 10.187 0.000 僵硬 6 周 5.46±1.25 7.46±1.43 8.281 0.000 12 周 3.64±1.11 6.74±1.18 15.062 0.000 6 個月 3.12±1.03 4.85±1.16 8.771 0.000 12 個月 3.06±1.01 4.15±1.14 5.629 0.000 功能 6 周 33.85±5.65 51.23±5.74 16.992 0.000 12 周 20.23±4.57 42.64±5.52 24.585 0.000 6 個月 25.01±4.47 45.81±5.15 23.995 0.000 12 個月 22.34±4.98 28.57±5.07 20.195 0.000 SF-36 軀體健康 6 周 39.52±5.37 36.12±5.46 3.495 0.000 12 周 44.94±5.27 37.98±5.31 7.366 0.000 6 個月 43.02±5.33 37.14±5.23 6.221 0.000 12 個月 41.73±5.21 37.15±5.04 4.976 0.000 精神健康 6 周 52.85±4.27 52.72±4.32 0.169 0.867 12 周 53.77±4.11 53.93±4.28 0.212 0.832 6 個月 53.06±4.18 54.18±4.32 1.466 0.145 12 個月 52.52±4.34 54.04±4.42 1.932 0.056

六、觀察組中治療效果顯著的典型病例

治療后 12 個月骨髓病灶較治療前明顯縮小 ( 圖 4a、b)。治療前鞍點關節間隙 5.02 mm，內側關節間隙 3.58 mm，治療后 12個月，鞍點關節間隙增加至 6.48 mm，內側關節間隙增加至 4.13 mm(圖 4c、d)。治療前軟骨病變以及積液，治療后 12 個月顯示軟骨再生，軟骨形態更加完整，積液消失(圖 4e、f)。

圖4 觀察組患者中治療效果顯著的典型病例膝關節 MRI a、b：治療后骨髓病灶較治療前明顯縮小；c、d：治療前及治療后鞍點關節間隙由 5.02 mm 增加至 6.48 mm；內側關節間隙由 3.58 mm 增加至 4.13 mm；e、f：治療后顯示軟骨再生，軟骨形態更加光滑，積液消失(注：藍色線代表治療前，紅色線代表治療后 12 個月)Fig.4 MRI of a typical case in the observation group a - b: Smaller bone marrow lesions after treatment; c - d: Sellar joint space increased from 5.02 mm to 6.48 mm after treatment, and medial joint space increased from 3.58 mm to 4.13 mm after treatment; e - f: Smooth cartilage regeneration without effusion after treatment(Notice: The blue line represented the image before treatment, while the red line represented the image 12 months after treatment)

討論

臨床上用于治療 KOA 藥物依其作用方式大體可分為改善癥狀與改善軟骨代謝兩大類。但是改善癥狀類藥物不能從根本上逆轉 KOA 病理發展。隨著中藥提取技術發展，應用中藥制劑提取液治療 KOA 報道也日漸增多，相關基礎實驗研究也均予以支持。SMI 能有效地保護軟骨細胞及維持軟骨的完整性，降低炎癥細胞因子水平，對骨關節炎起到一定治療作用[8]。本項研究通過網絡藥理學詳細闡述 SMI 治療 KOA 的物質基礎及分子機制，并通過臨床對照試驗進行效果驗證。證實 SMI 在 KOA 中具有多成分、多途徑、多靶點協同干預作用特點，并可以有效逆轉 KOA 病理發展，提高膝關節功能及生活質量。

本研究將 106 個 SMI 靶點映射到 2064 個 KOA 靶基因中，得到 25 個 SMI 抗 KOA 關鍵靶點，并構建出 SMI-關鍵靶點-KOA 復合目標網絡圖。麥冬中的麥冬酮 A、鳥苷、豆甾醇、麥冬 A 及尿苷；紅參中的 β-谷固醇、人參皂苷 rh2 是復合目標網絡中主要有效化學成分。該網絡展現一種有效化學成分可以對應一個乃至多個靶點，多個靶點對應同一個有效化學成分，說明 SMI 在治療 KOA 方面具有多成分、多靶點協同干預作用特點。麥冬酮 A 可以下調白介素-6(interleukin-6，IL-6) 和 IL-8 表達而抵抗因衰老導致的慢性炎癥反應疾病[15]。鳥苷類似物可以降低大鼠關節炎特征，減少滑膜組織免疫細胞浸 潤[16]。KOA 兔模型[17]及大鼠模型[18]結果顯示豆甾醇可以降低軟骨降解，并抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP) 表達。麥冬 A 通過抑制大鼠血漿或肺組織中 IL-6、腫瘤壞死因子-α、轉化生長因子 β1 等降低肺部炎癥反應[19]。尿苷通過抑制 KOA 大鼠軟骨細胞肥大和凋亡，具有抗炎反應傷害和軟骨保護作用[20]。

β-谷固醇通過抑制脂多糖與 NF-κB 通路中 Toll 樣受體 4 的結合，減輕小鼠炎癥反應[21]，也可以促使 KOA 大鼠軟骨完全再生[22]。人參皂苷 rh2 通過調節 NF-κB 通路減輕哮喘小鼠模型的過敏性氣道炎癥[23]，抑制血管內皮生長因子誘導的新生血管形 成[24]。因此，結合上述研究背景，SMI 治療 KOA 中的有效化學成分具有抗炎反應、促進軟骨再生及新生血管形成作用。

通過 GO 分析，結果顯示 SMI 的關鍵靶點主要涉及脂多糖反應、細胞凋亡過程、線粒體外膜等生物學過程。KEGG 富集分析結果顯示神經退行性變信號通路 - 多種疾病是 SMI 主要治療 KOA 途徑。但在 KOA 中，SMI 是如何抑制神經退行性變信號通路 - 多種疾病需要進一步研究。本研究通過拓撲分析得出 CASP1、CASP3、CASP9、NFKBIA、ESR1、CAT 是核心關鍵靶點，根據對應有效化學成分進行分子對接，結果表明 CASP1、CASP3、CASP9、NFKBIA、ESR1、CAT 與 SMI 有效活性成分的結合能均 < -5.0 kcal / mol。說明核心關鍵靶點與 SMI 有效化學成分具有較好親和力。表明這些有效化學成分可能在治療 KOA 中起著重要作用。但需要進一步的體內體外研究證實可能存在的治療軸。CASP1 主要產生具有生物活性的 IL-1β 和 IL-18，觸發炎性小體[25]，軟骨退變及降解是 KOA 的顯著特征，而細胞凋亡是軟骨降解根本原因。而 CASP3、CASP9 參與細胞凋亡并促進 KOA 軟骨降解過程[26]。NFKB1A 調節 NF-κB 信號通路，改變細胞因子表達譜，從而導致易感個體的炎癥反應，參與髖部關節炎發 生[27]。ESR1 與 KOA 患者 IL-1β 和 IL-6 表達相關[28]并增加中國漢族女性 KOA 易感性[29]。CAT 參與氧化應激反應介導軟骨細胞損傷[30-31]。

本研究詳細闡述 SMI 治療 KOA 的物質基礎及分子機制。在此基礎上本團隊開展一項臨床對照試驗進行治療效果驗證。治療后 6 周、12 周、6 個月、12 個月，觀察組患者 WOMAC 中疼痛、僵硬、功能評分低于對照組患者；軀體健康評分高于對照組患者。表明 SMI 可以有效改善 KOA 的臨床癥狀及提高生活質量。在隨訪末期，筆者還觀察到一些患者骨髓病灶較治療后明顯縮小，關節間歇增加及軟骨再生現象。SMI 治療 KOA 的物質基礎及分子機制研究結果正是上述研究結果背后機制。

綜上所述，SMI 治療 KOA 具有多成分、多途徑、多靶點協同干預作用特點，能明顯改善 KOA 的臨床癥狀及提高生活質量并延緩 KOA 病程進展。