治療宮頸癌的六君子湯主要活性成分和關鍵靶點基因篩選及生物學功能分析

楊露銀，楊忠明

1西南醫科大學，四川瀘州 646000；2西南醫科大學附屬中醫醫院腫瘤科

宮頸癌（Cervical Cancer，CC）是女性常見惡性腫瘤之一。流行病學數據表明CC在全球女性癌癥中的發病率及病死率均較高，且呈年輕化趨勢［1］。因CC臨床表現缺乏特異性，多數患者就診時病情已處于晚期，導致臨床總體療效不高。放化療治療常導致CC患者出現不良反應，使得患者治療的依從性較差。尋求包括中醫藥在內的綜合CC治療方案是目前的研究熱點。六君子湯出自《醫學正傳》，由人參、白術、茯苓、甘草、陳皮、半夏六味藥組成，主治脾胃氣虛兼痰濕證。六君子湯具良好的抗腫瘤作用，基礎實驗證實其能抑制癌細胞增殖、促進凋亡，抑制腫瘤細胞遷移和血管生成，調節免疫功能及改善患者惡病質等；臨床研究［2］數據亦表明該方能減輕放化療不良反應、提升腫瘤患者的免疫功能等［2］。但目前六君子湯治療CC的藥理學作用及其機制尚不完全明確，仍需進一步研究。2020年8月—2021年1月，我們采取網絡藥理學的方法，篩選六君子湯治療CC的主要活性成分及其關鍵靶點基因，分析六君子湯主要活性成分關鍵靶點基因的生物學功能，以期為六君子湯治療CC的藥物臨床應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 六君子湯治療CC的主要活性成分分析 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索六君子湯中人參、白術、茯苓、陳皮、半夏、甘草的化學成分，依據ADME原則，篩選出OB值（Oral Bioavailability）≥30%，DL值≥0.18的活性成分。

1.2 六君子湯治療CC的關鍵靶點基因篩選

1.2.1 六君子湯主要活性成分作用靶點基因篩選 將篩選出的活性成為在DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）數據庫中匹配相關藥物作用靶點基因，并運用Uniport（https：//www.uniprot.org/）數據庫對獲取的藥物作用靶點名稱進行校正。在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中查詢所獲取的活性成分的2D分子結構式并保存；將獲取的2D分子結構式導入SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）以 預測活性成分的作用靶點基因，以Probability≥0.3為標準最終得到六君子湯活性成分的作用靶點基因。

1.2.2 CC的疾病相關作用靶點基因篩選 在Gene Cards（https：//www.genecards.org/）數據庫及OMIM（https：//omim.org/）數據庫中以“cervical cancer”、“cervical carcinoma”為檢索對象進行檢索，獲取CC的治療的相關靶點，并匯總、去重。由于疾病靶點信息較多，故依據score得分篩選出中位數，并選取score得分在中位數前的靶點信息作為疾病靶點。將獲取的疾病靶點導入Uniprot中，選定范圍為“Homo sapiens”，將靶點信息轉化為對應的Uniprot ID及基因名稱，最終得到CC的疾病相關作用靶點基因。

1.2.3 六君子湯治療CC的關鍵靶點基因篩選 治療CC的六君子湯主要活性成分作用靶點基因和CC疾病相關作用靶點基因導入Venny2.1.0在線工具（https：//bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index.html）進行韋恩圖繪制，獲取共同靶點。將獲取的共同靶點信息上傳至string數據平臺（https：//string-db.org）進行網絡拓撲分析，設定高置信度為0.9，并隱藏無關聯節點后得到六君子湯主要活性成分作用靶點基因與CC疾病相關作用靶點基因的PPI網絡。將獲取的PPI網絡導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理，使用cytoHubba插件及Net-workAnalyzer進行網絡分析，篩選度值（degree）前30的靶點為六君子湯治療CC的核心靶點。

1.3 六君子湯主要活性成分關鍵靶點基因的生物學功能 運用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行基因本體（GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析，分析六君子湯治療CC的關鍵靶點基因的生物學功能。GO富集結果包括生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component）及分子功能（molecular function，MF）三個方面，依據P-Value、count及Fold Enrichment等指標篩選出排名前10的結果進行富集；KEGG富集分析時，篩選P≤0.05的通路進行富集，并使用R語言繪制富集氣泡圖。將獲取的六君子湯主要活性成分、關鍵作用靶點基因及信號通路導入Cytoscape3.7.2軟件，繪制六君子湯主要活性成分—關鍵靶點基因—信號通路圖，進一步明確靶點進與信號通路在六君子湯治療CC中的作用。

2 結果

2.1 六君子湯治療CC主要活性成分 六君子湯治療CC的主要活性成分有槲皮素、山奈酚、柚皮素、β谷甾醇、豆甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、黃芩素、芒柄花黃素、川陳皮素、苜蓿素等149個。

2.2 六君子湯治療CC的關鍵靶點基因 六君子湯前6位活性成分的藥物的作用靶點基因有促分裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、促分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、信號轉導及轉錄激活蛋白（STAT3）、MAPK1、MAPK3、JUN、SRC、MAPK14、NR3CI、RELA、AKT1、TP53等331個。CC治療相關靶點有3 300個。將331個藥物活性成分作用靶點基因與3 300個疾?。–C）靶點合并、取交集，并進行維恩分析，得到222個藥物—疾病共同靶點。最終篩選出六君子湯治療CC的關鍵靶點基因有MAPK3、MAPK1、STAT3等30個。

2.3 六君子湯主要活性成分關鍵靶點基因的生物學功能 六君子湯治療CC關鍵靶點基因涉及BP條目99個、細胞組成條目13個、MF條目21個。六君子湯治療CC關鍵靶點基因主要參與的生物學功能為RNA轉錄、DNA鏈的特異性結合、細胞周期及細胞凋亡等，六君子湯治療CC關鍵靶點基因主要富集在腫瘤相關信號通路、癌癥中的蛋白多糖、ErbB信號通路等108條信號通路。六君子湯治療CC的主要活性成分—靶點基因—通路網絡關系圖見圖1。

圖1 六君子湯治療CC的主要活性成分—靶點基因—信號通路網絡關系圖

3 討論

目前臨床CC的治療方法以手術及放化療為主。隨中醫藥在腫瘤治療領域中的應用不斷擴寬，越來越多的證據表明中醫藥能增效減毒，提高腫瘤患者生存質量、延長生存期。六君子湯作為臨床應用十分廣泛的經方之一，具有良好的抗腫瘤、增強免疫功能、改善惡病質、減輕放化療不良反應等作用。本研究通過網絡藥理學研究方法，通過對六君子湯的活性成分、作用靶點基因的篩選，構建成分—靶點網絡，分析其生物過程與信號通路，從而推測六君子湯治療CC的作用機制。

通過網絡藥理學方法，初步篩選出六君子湯治療CC的活性成分主要有槲皮素、山奈酚、柚皮素、β谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、芒柄花黃素、川陳皮素、苜蓿素等。槲皮素（Quercetin）主要通過誘導腫瘤細胞的凋亡發揮抗腫瘤作用，可以通過滅活caspase/Cyto-c途徑、抑制AP-2β/h TERT、抑制NF-κB/COX-2和阻斷Akt/ERK1/2信號通路而發揮抗腫瘤作用［3］。山奈酚（Kaempferol）能抑制ERK/MAPK通路和PI3K-AKT通路誘導腫瘤細胞凋亡，還能誘導細胞周期阻滯，抑制癌細胞黏附、遷移與侵襲等方式發揮其抗腫瘤活性［4］。柚皮素（Naringenin）可以通過誘導ROS的產生，促進JNK磷酸化從而激活JNK/Bcl2信號通路，繼而誘導CC細胞凋亡，抑制CC細胞的生長［5］。β-谷甾醇（beta-sitosterol）能通過介導AMPK、PTEN和HSP90發揮抗腫瘤作用，豆甾醇（Stigmasterol）能下調FOS、MYC、RAS、Bcl-2等多種癌基因和上調NF-2為代表的抑癌基因和Map2k6的表達；除此之外，還能增加G0/G1期細胞比例、降低G2/M期細胞比例，上調Bax蛋白、P53基因等促凋亡基因的表達，激活促凋亡蛋白caspase-8、caspase-9的表達，并通過損傷細胞DNA的方式，誘導腫瘤細胞凋亡［6-7］。

黃芩素（Baicalein）具有多途徑、多靶點及多層次抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管新生、逆轉腫瘤細胞化療抗藥性、抑制腫瘤侵襲和轉移等效應［8-9］。芒柄花黃素（Formononetin）可以通過Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白調節多種信號通路誘導細胞凋亡，還能在體外和體內通過調節細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白B1和細胞周期蛋白D1等介質誘導抗腫瘤特性細胞周期阻滯，通過激活STAT、PI3K/AKT及MAPK信號通路抑制細胞增殖，通過調節VEGF、FGF2、MMP-2和MMP-9等達到抗腫瘤作用［10］。

川陳皮素（Nobiletin）主要通過抑制腫瘤細胞的生長和增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，調節癌細胞周期和蛋白表達以及與化療藥物的聯合以增強抗腫瘤作用［11］。苜蓿素（Medicarpin）能通過下調Bcl-2和上調Bax蛋白誘導細胞凋亡，同時能降低內皮細胞上ROS的生成從而下調VEGFR2信號傳導，還能通過抑制腫瘤細胞中HIF-1積聚來降低VEGF的表達［12］。通過上述分析可以得知，六君子湯多種活性成分均有抗腫瘤活性，能從腫瘤細胞增殖、遷移及細胞周期等方面發揮抗腫瘤作用。

六君子湯治療CC的關鍵作用靶點基因包括STAT3、MAPK家族相關蛋白、JUN等。SATA3作為信號蛋白，能參與多種和腫瘤形成相關的信號通路，在多種惡性腫瘤中呈高表達，能抑制細胞凋亡，促進細胞異常增殖從而加速腫瘤細胞的增殖和轉移，在其與宮頸上皮內病變和CC組織表達的研究中，也提示STAT3的過表達與CC的發生發展有較為密切的關系［13］。MAPK家族相關蛋白作為蛋白激酶，在多種信號通路中充當信號轉導成分，能調控細胞周期，促進血管內皮細胞增殖和新血管生成，從而加速腫瘤的生長，促進癌細胞的擴散［14］。JUN在細胞中常以亮氨酸拉鏈結構域的異源二聚體AP-1的形式存在，可因結構改變而被激活為癌基因。JUN的過表達可以導致AP-1的活化，進而調控下游靶基因促進轉移瘤新生血管形成，導致腫瘤細胞增強和黏附分子的異常表達，從而促進腫瘤轉移、侵襲［15］。這表明六君子湯可能通過抑制上述靶點基因的表達從而對CC產生治療作用。

KEGG通路富集結果表明，六君子湯治療CC可能與癌癥相關信號通路、ErbB信號通路、催乳素信號通路、HIF-1信號通路及MAPK信號通路等有關。在癌癥相關通路中，包括Wnt信號通路、PI3K-Akt信號通路、Jak-STAT信號通路及MAPK信號通路等經典信號通路均參與其中。Wnt通路的異常調控可能導致CC的發生［16］。PI3K/Akt通路是細胞生長、增殖和存續的一個關鍵信號。有證據表明這一途徑還可發出促進細胞死亡信號，尤其是促進細胞壞死的信號［17］。在PI3K/Akt通路與CC的關系的研究［18-19］中發現，BMX能通過PI3K/Akt和STAT3信號通路促進細胞增殖和CC細胞的形成，而FOX-C1能直接靶向激活PI3K/Akt通路從而促進CC細胞存活、增殖和上皮—間質轉化。

Akt信號通路作為HPVE6、E7癌基因蛋白的下游靶點，是CC發展的主要介質。JAK-STAT是與細胞凋亡有關的傳導通路。研究［20］表明，JAK-STAT通路的活化與多種腫瘤的發生有密切聯系，通過調節JAK-STAT通路能有效抑制Hela細胞的增殖。MAPK通路是細胞增殖、應激、炎癥、分化、功能同步化、轉化、凋亡等信號轉導通路的共同交匯通路之一，能把細胞外的信號傳遞到細胞內，從而參與細胞增殖、分化、癌變、轉移、凋亡等多種生物過程。由此可推測，六君子湯的多種活性成分能夠通過多種腫瘤相關通路對CC產生治療作用。

綜上所述，六君子湯治療CC的活性成分主要有槲皮素、山奈酚、柚皮素等149個。六君子湯活性成分與宮頸癌治療的共同靶點222個。六君子湯可能通過STAT3、MAPK家族相關蛋白、JUN蛋白等靶點，調控JAK-STAT、Wnt信號通路、PI3K-Akt信號通路及MAPK信號通路，作用于RNA轉錄、DNA鏈的特異性結合、細胞凋亡等過程。