血清miR-122a表達、HMGB1水平對膿毒癥并發肝損傷患兒預后的預測效能

馬偉科，楊衛國，林燕鴻，張蕾，魏鋒

1深圳市兒童醫院重癥醫學科，廣東深圳 518038；2深圳市兒童醫院消化內科

膿毒癥是感染引起的全身反應綜合征，為全球兒童發病、病死的主要原因，全球每年有超過120萬例兒童患膿毒癥［1］。肝損傷是膿毒癥的常見并發癥，是病情進展為多器官功能障礙的早期臨床表現之一，患兒病死率高達60%［2］。因此，早期對患兒進行預后評估具有重要意義。研究［3］表明，炎癥反應、腸道細菌/內毒素移位與膿毒癥并發肝損傷（sepsisassociated liver injure，SALI）的發生發展密切相關。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類內源性非編碼小RNA，可調控細胞多種生物學功能，在肝臟疾病的發生發展中發揮重要作用［4］。miR-122a是特異性高表達于肝臟組織的一種miRNA。miR-122a參與了炎癥反應，與多種肝臟疾病有關［5］。高遷移率 族 蛋 白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一類高度保守蛋白質，是啟動和維持炎癥瀑式反應的中心分子，可促進多種炎性介質的生成和釋放［6］。miR-122a、HMGB1是否可用于SALI患兒的預后評估目前暫無相關報道。我們檢測了SALI患 兒 血 清miR-122a、HMGB1，探 討miR-122a、HMGB1在SALI患兒預后評估中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取深圳市兒童醫院兒童重癥監護室2018年7月－2020年5月間收治的膿毒癥患兒198例，根據是否合并肝損傷分為兩組，肝損傷組80例，其中男44例，女36例；年齡2～12歲，中位8歲；BMI 13～17 kg/m2，中位14 kg/m2。根據TBIL或ALT較正常水平升高程度［8］評估SALI組肝損傷程度，重度為TBIL升高＞3倍或ALT升高＞5倍，中度為TBIL升高2～3倍或ALT升高3～5倍，輕度為TBIL升高1倍或ALT升高1～2倍。根據肝損傷程度將肝損傷組分為重度37例、中度23例、輕度20例。無肝損傷組118例，其中男68例，女50例；年齡1～12歲，中位7歲；BMI 13～17 kg/m2，中位15 kg/m2。納入標準：①膿毒癥符合《兒童膿毒性休克（感染性休克）診治專家共識（2015版）》［7］診斷標準；②肝損傷符合《國際兒科敗血癥共識會議：小兒敗血癥和器官功能障礙的定義》［8］診斷標準：血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）＞34.1μmol/L或丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）＞80 U/L；③患兒家屬或監護人對研究知情同意；④臨床資料完整者；⑤年齡1～12歲；排除標準：①藥物、中毒等導致的肝損傷者；②既往存在肝臟疾病病史；③自身免疫性疾病者；④惡性腫瘤者；⑤肝炎病毒感染者。另選取同期60例體檢健康兒童為對照組，其中男24例，女36例；年齡3～12歲，中位7歲；BMI 13～17 kg/m2，中位14 kg/m2；三組年齡、性別比例等一般資料具有可比性（P均＞0.05）。本研究經本院倫理委員會批準同意。

1.2 各組血清miR-122a、HMGB1檢測 采集肝損傷組和無肝損傷組入院后次日清晨，對照組入院當日6 mL空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min，半徑8 cm，分離血清，置于-80℃冰箱中待檢。取3 mL，TRIzol試劑盒（北京百奧森泰生物技術有限公司）提取血清總RNA，TakaRa逆轉錄試劑盒（北京拜爾迪生物技術有限公司）轉錄合成互補DNA，加入miR-122a引物序列（正向引物：5'-GGGAAGTGGATACGAAGAATGC-3'，反 向 引 物：5'-CGACTTTAACACAGCGTGGAG-3'），實時熒光定量法檢測，反應條件：95℃15 s、65℃20 s、75℃15 s，循環40次，以U6做內參校正（正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反 向 引 物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'），反應結束后得到各反應管Ct，以2-ΔΔCt代表miR-122a的相對表達量。另取3 mL，ELISA法（北京方程生物科技有限公司）測定血清HMGB1，所有操作均嚴格按使用說明書進行。重復3次，取平均值。

1.3 統計學方法 采用SPSS26.0統計軟件進行數據處理。計數資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料間比較采用Z檢驗；正態分布且方差齊計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較q檢驗；偏態分布或方差不齊計量資料以M（QL，QU）表示，兩組間Z檢驗，多組間H檢驗，組間兩兩比較Bonferroni法校正；對肝損傷組患兒隨訪28 d，以PICU時間、肝損傷程度（重度=3；中度=2；輕度=1）、miR-122a、HMGB1為自變量，預后情況為因變量（死亡=1，存活=0），采用多因素Logistics回歸分析法分析SALI患兒不良預后的影響因素；繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析血清miR-122a表達、HMGB1水平對SALI患兒不良預后的預測價值，曲線下面積（area under curve，AUC）的比較采用Z檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組及不同肝損傷程度的SALI患兒血清miR-122a表達、HMGB1水平比較 肝損傷組、無肝損傷組、對照組血清miR-122a相對表達量分別為2.85±0.56、2.61±0.45及1.01±0.12，血清HMGB1水平分別為29.33（25.50，35.40）、20.45（16.20，24.64）及14.65（11.59，17.60）μg/L。與對照組比較，肝損傷組血清miR-122a相對表達量、HMGB1水平均升高，與無肝損傷組、對照組比較，肝損傷組血清miR-122a表達、HMGB1水平均升高（P均＜0.05）。

重、中、輕度SALI患兒血清miR-122a相對表達量分別為3.29±0.37、2.74±0.30及2.17±0.28，血 清HMGB1水 平 分 別 為35.58（31.65，39.41）、27.88（27.24，30.45）、22.15（23.90，24.79）μg/L。與輕度組比較，中度組血清miR-122a表達、HMGB1水平高（P均＜0.05），與中、輕度組比較，重度組血清miR-122a表達、HMGB1水平高（P均＜0.05）。

2.2 SALI患兒不良預后的影響因素 SALI患兒死亡48例、存活32例，死亡者男28例、20女例，年齡8（6，10）歲，BMI 15（13，16）kg/m2，PICU時間10.5（5，12）d，機械通氣時間2.5（2，4）d，心率（116.65±6.96）次／分，感染部位為呼吸系統10例、消化系統12例、泌尿系統16例、中樞神經系統9例及其他1例，肝損傷程度為重度28例、中度11例、輕度9例，血清miR-122a相對表達量為3.19±0.40，血清HMGB水平為133.62（29.79，38.44）μg/L。存活者男16例、女16例，年齡8（5，9）歲，BMI 14（13，15）kg/m2，PICU時間5（3，11）d，機械通氣時間3（1，4）d，心率（115.44±4.61）次／分，感染部位為呼吸系統7例、消化系統7例、泌尿系統12例、中樞神經系統4例及其他2例，肝損傷程度為重度9例、中度12例、輕度11例，血清miR-122a相對表達量為2.35±0.37，血清HMGB1水平為24.71（22.96，27.22）μg/L。二者PICU時間、肝損傷程度和血清miR-122a相對表達量、HMGB1水平差異具有統計學意義（P均＜0.05）。重度肝損傷、miR-122a、HMGB1為SALI患兒不良預后獨立危險因素（P＜0.05）。SALI患兒不良預后的Logistics回歸分析結果見表1。

表1 SALI患兒不良預后影響因素的Logistics回歸分析結果

2.3 血清miR-122a表達、HMGB1水平對SALI患兒不良預后的預測價值 當截斷值是0.490時，血清miR-122a表達預測SALI患兒不良預后的AUC為0.793，敏感度77.08%，特異度71.87%。當截斷值是27.88μg/L時，血清HMGB1水平預測SALI患兒不良預后的AUC為0.788，敏感度64.58%，特異度78.12%，當截斷值是0.46時，血清miR-122a+HMGB1預測SALI患兒不良預后的AUC為0.921，敏感度87.50%，特異度81.25%。血清miR-122a+HMGB1聯合預測SALI患兒不良預后的AUC大于miR-122a、HMGB1（Z=4.093、3.623，P均＜0.05），敏感度、特異度也高于血清miR-122a、HMGB1單獨預測。

3 討論

肝臟是人體具有解毒、代謝、免疫等重要功能的器官，同時也是機體最大的網狀內皮系統，是膿毒癥早期易侵及損傷的器官之一［9-10］。肝損傷是膿毒癥患者病情發展進入多器官功能障礙綜合征的重要標志，其重要性高于中樞神經、循環、呼吸系統等預警指標，因此早期評估患者的預后極為重要。膿毒癥發生后，肝臟可介導免疫反應清除細菌和內毒素，但同時也會引起肝臟炎癥反應、免疫抑制，最終引起肝臟損傷；同時，腸道作為機體最大的細菌/內毒素儲存地，隨著內毒素產生量增加，可破壞腸黏膜，進入血液，再經血液進入肝臟，超過肝臟自身處理能力，加重肝損傷程度［3］。

miRNAs是一類內源基因編碼長度為20～24個核苷酸的RNA分子，其家族成員主要存在動植物細胞核、細胞外及血液循環中，可互補配對mRNA堿基序列，結合靶miRNA的3’-非翻譯區，抑制靶miRNA翻譯在轉錄后水平調控基因的表達，參與了細胞多種生命過程［11］。miR-122a是肝臟特異性高表達miRNA，占總肝臟miRNAs的70%，參與調控肝細胞分化、增殖、凋亡等眾多生物學過程［12］。目前研究證實，miR-122a還具有調控肝炎病毒復制、脂質代謝等功能，在miR-122a在肝細胞癌、纖維化、脂肪性肝炎等肝臟疾病中發揮作用。RAHMEL等［13］研究顯示，膿毒癥患者血清miR-122表達明顯上調，與患者器官功能障礙發生和預后相關。而miR-122a作為miR-122家族一員，是否也與膿毒癥患者器官功能障礙有關？研究發現，miR-122a可通過抑制B淋巴細胞瘤-2、B淋巴細胞瘤-XL表達，誘導淋巴細胞凋亡，抑制機體免疫功能［14］。本研究結果顯示，對照組、無肝損傷組、肝損傷組血清miR-122a相對表達量逐漸提升，提示miR-122a可能參與了SALI發生。進一步分析顯示，血清miR-122a相對表達量隨著肝損傷加重而提升，為SALI患兒不良預后獨立危險因素，分析與miR-122a可抑制機體免疫功能、增強細菌和內毒素介導炎癥反應有關。閉合蛋白是一種跨膜緊密連接蛋白，過低或過度表達均會引起緊密連接屏障功能障礙。腸道中腫瘤壞死因子-α介導的閉合蛋白表達主要由miR-122a調節，提示miR-122a可能通過上調閉合蛋白的表達，引起腸屏障功能障礙，促進腸道細菌/內毒素移位，加重肝損傷，導致患兒預后不良［15］。

HMGB1是一種非組蛋白核蛋白，廣泛分布于心、肝、腎、肺、腦、淋巴等組織中，在進化過程中高度保守，在細胞核中具有調節轉錄、復制、DNA修復、核小體形成等作用，對維持細胞穩態功能具有重要作用［16］。HMGB1可通過被動釋放或主動分泌從細胞核進入細胞質或細胞外，從而調節細胞組織應激反應，并結合Toll樣受體2、Toll樣受體4、晚期糖基化終末產物等相應胞膜受體，參與炎癥反應［17］。LEE等［18］對小鼠注射重組HMGB1，發現實驗小鼠出現膿毒癥表現，再次注射姜酮靶向抑制HMGB1表達，小鼠體內組織損傷和總死亡率明顯降低，說明HMGB1參與了膿毒癥發生。YANG等［19］研究發現，HMGB1過度表達與肝細胞死亡程度呈正相關，參與急性肝衰竭的全身炎癥和多器官衰竭，說明HMGB1參與了肝損傷。本研究結果顯示，對照組、無肝損傷組、肝損傷組血清HMGB1水平逐漸提升，提示HMGB1可能參與了SALI發生。進一步分析顯示，血清HMGB1水平隨著肝損傷加重而提升，為SALI患兒不良預后獨立危險因素，分析可能原因為胞外HMGB1可通過結合晚期糖基化終末產物受體，磷酸化促分裂原活化蛋白激酶，引起活化蛋白-1和核因子-κB核內轉移，啟動炎癥的級聯反應［20］。同時過度HMGB1表達介導的炎癥反應還可提升腸道黏膜通透性，促進腸道細菌/內毒素移位［21］。

進一步分析SALI患兒不良預后的危險因素后發現，死亡及存活患兒的PICU時間、肝損傷程度和血清miR-122a、HMGB1水平差異明顯。重度肝損傷、miR-122a、HMGB1為SALI患兒不良預后獨立危險因素。重度肝損傷說明患兒病情嚴重，因此患兒的預后更差。

血清miR-122a表達、預測SALI患兒不良預后的AUC、敏感度、特異度為0.793、77.08%、71.87%，血清HMGB1水平分別為0.788、64.58%、78.12%，說明miR-122a與HMGB1均對SALI患兒不良預后具有一定預測價值，但二者聯合檢測的AUC明顯增加，且敏感度、特異度更高，說明聯合檢測血清miR-122a、HMGB1水平更有利于評估SALI患兒不良預后。

綜上所述，隨肝損傷嚴重程度升高，膿毒癥患兒血清miR-122a表達、HMGB1水平升高。SALI患兒不良預后的獨立危險因素為重度肝損傷、血清miR-122a及HMGB1水平升高。血清miR-122a表達、HMGB1水平聯合檢測可用于預測SALI患兒的不良預后。