1例胎兒唐篩18三體高風險孕婦產前羊水細胞X染色體STRs相關位點基因拷貝數、細胞核型分析

龍若庭，陳淑霞，林萃，羅華玉，李戀湘，李淑娜

珠海市婦幼保健院檢驗科，廣東珠海 519001

當個體內存在兩種或兩種以上不同核型的細胞系時，稱為嵌合體。研究［1-2］發現，嵌合體中異常核型比例越高，細胞畸變發生越早，致畸越嚴重，臨床癥狀越明顯。因此，嵌合體是導致胎兒出生缺陷的常見原因之一。嵌合體的檢測需經細胞培養和繁瑣制片染色過程，檢測比較耗時，且其對＜5 Mb的染色體片段分辨率較低，所以小片段染色體異常的臨床檢測存在局限性。熒光定量聚合酶鏈反應（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，QFPCR）技術可通過擴增染色體上短串聯重復序列（STR）位點來比較遺傳物質的拷貝數，判斷相應染色體的數目，提高檢測的靈敏度，加快檢測進度，緩解產前孕婦的心理壓力，目前在臨床產前檢驗中的應用越來越廣泛［3-9］。目前臨床常用的非整倍體QFPCR試劑盒主要針對常見的13、18、21、X及Y染色體，通過分別設計引物，可同時檢測多個STR位點，測算染色體上基因位點的拷貝數。但檢測中應用PCR檢測STR位點，對于低比例數目異常嵌合體的檢測仍存在一定局限性，易造成漏診［10-12］。我們抽取1例胎兒唐氏篩查（以下簡稱唐篩）18三體高風險的孕婦產前羊水細胞，采用QF-PCR法多個非整倍體試劑盒及X染色體STRs位點檢測試劑盒檢測STRs基因拷貝數，并分析其染色體核型，旨在為嵌合體的遺傳學分析及產前診斷提供更多的數據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者，女，34歲，因胎兒唐篩18三體高風險于2020年10月就診于我院產前診斷中心。孕21+1周，就診時無發熱、腹痛、陰道流血、流水等癥狀；否認家族遺傳病史及不良生育史。本研究通過了珠海市婦幼保健院醫學倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》要求。

1.2 孕婦羊水細胞X染色體STRs相關點位基因拷貝數檢測 ①DNA抽提：取500μL羊水于EP管，5 000 rpm/min離心5 min，棄上清，沉淀中加入生理鹽水1 mL，顛倒混勻后，5 000 rpm/min離心5 min，棄上清，在沉淀中加入8%chelex 10 060μL、10 mg/L的蛋白酶K 5μL，振蕩混勻，56℃溫浴2 h。100℃變性10 min，13 000 rpm/min離心10 min，取上清作為DNA模板備用。②染色體非整倍體QF-PCR檢測：采用達瑞非整倍體檢測試劑盒（廣州達瑞生物，LOT：202002）檢測X染色體STR18三體綜合征相關位點拷貝數。取羊水DNA 2μL作為模板。按說明書配置擴增體系（10μL），在ABI9700基因擴增儀上進行STR擴增。循環條件：95℃5 min；95℃30 s，58℃40 s，72℃50 s，共25個循環；72℃10 min，4℃60 min。擴增結束后在ABI3500DX遺傳分析儀（美國ABI公司）進行毛細管電泳，結果用GeneMapper ID-X 1.0軟件（美國ABI公司）GeneMapper ID-X 1.0軟件（美國ABI公司）。③采用Devyser緊湊型V3試劑盒（瑞典，LOT：19I144）檢測X染色體上7個性別染色體STR位點，評估X染色體上遺傳信息拷貝數。取羊水DNA 1μL作為模板。按說明書配置擴增體系（10μL），在ABI9700基因擴增儀上進行STRs擴增。循環條件：95℃15 min；94℃30 s，58℃90 s，72℃190 s，共27個循環；72℃30 min；4℃。擴增結束后在ABI3500DX遺傳分析儀（美國ABI公司）進行毛細管電泳，結果用GeneMapper IDX 1.0軟件（美國ABI公司）GeneMapper ID-X 1.0軟件（美國ABI公司）。④采用AGCU 19X-STR多重熒光復合擴增試劑盒（無錫中德美聯，LOT：2007073）對19X-STRs進行擴增，分析X染色體STRs位點信息。取羊水DNA 1μL作為模板。按AGCU 19XSTR多重熒光復合擴增試劑盒說明書配置擴增體系，并編制擴增程序。擴增在ABI9700基因擴增儀上（美國ABI公司）進行，擴增后用ABI3500DX遺傳分析儀（美國ABI公司）進行毛細管電泳，GeneMapper ID-X 1.0軟件（美國ABI公司）。

1.3 孕婦羊水細胞染色體核型分析 取無菌操作采集的羊水細胞，5 000 r/min離心8 min，棄上清，將沉淀接種至裝有5 mL羊水細胞培養基（廣州和能生物，LOT：AF20191101）的培養瓶，37℃、5%二氧化碳培養箱培養7～8 d，待發亮細胞生長至5～6個克隆時，換液再培養24 h，加入秋水仙素0.25μg/mL，處理45 min，收集培養細胞，經低滲、固定、滴片、G帶染色，獲取羊水細胞染色體核型。每份標本制備A、B兩線染色體利用染色體分析系統進行中期細胞核型分析。兩名臨床醫師分A、B雙線分析同一標本，每線計數15個核型，分析3個形態好的染色體核型，嵌合型加倍計數，參見ISCN（2016版）進行核型分析診斷［13］。

2 結果

2.1 X染色體STRs相關點位基因拷貝數 達瑞生物非整倍體檢測試劑盒檢測結果為，X染色體上C4區SRY的STR位點，沒有擴增產物，說明樣本為女性，C1、C2、C3、C5 X染色體STR位點均為單峰，C6所在Xq13區STR位點出現1個不平衡雙峰，說明Z染色體上Xq13區帶基因可能存在2個拷貝，其他區域基因僅有1個拷貝（圖1）。

圖1 本例孕婦產前羊水細胞X染色體Xq13區域C2、C3、C5、C6位點基因拷貝情況

Devyser緊湊型V3試劑盒檢測結果為，羊水細胞X染色體上5個性別染色體STRs位點（XY1、XY2、X1、X3、X9）均為單峰，2個X染色體與常染色體STRs位點T1、T3位點上峰高之比為1：1和1：2。說明羊水細胞在X染色體上Xq13區域上基因有2個拷貝，在T3所在Xq21.1區域上，基因僅有1個拷貝（圖2）。

圖2 本例孕婦產前羊水細胞X染色體XY1、XY2、X1、X3、X9等位點基因拷貝情況

無錫中德美聯AGCU 19X-STR多重熒光復合擴增試劑盒檢測結果為，在X染色體上DXS10159、DXS10164、DXS10162、DXS10079、DXS10074等5個位點上有不平衡雙峰，而其余14個X-STRs位點均為單峰（圖3）。

圖3 本例孕婦產前羊水細胞X染色體DXS10159、DXS10164、DXS10162、DXS10079、DXS10074等位點基因拷貝情況

2.2 羊水細胞染色體核型分析結果 共計數100個羊水細胞染色體核型，其中46，Xn，+mar占33組，45，X占67組。最終羊水細胞核型分析為：46，Xn，+mar［33］/45，X［67］，為嵌合型核型。羊水細胞染色體核型分析結果見圖4。

圖4 本例孕婦羊水細胞染色體核型分析結果

3 討論

QF-PCR法通過對染色體上的標記STR遺傳位點進行擴增，將同源染色體上兩條等位基因的熒光峰高或峰面積的計算來量化染色體攜帶遺傳物質的數量。每一個正常的二倍體樣本與之相對應的則是體細胞染色體上的等位基因。根據國際公認的判斷標準（歐盟ACC/CMGS），Devyser緊湊型V3試劑盒（瑞典）采用在人群中具有高度的異質性和多態性的STR基因座，設計了7個性別染色體STR位點來評估X染色體上遺傳信息的拷貝數。該試劑盒檢測到本例羊水標本的5個性別染色體STRs為單峰，未能提供X染色體上STR拷貝數的有效信息，2個X染色體與常染色體STRs位點T1、T3位點上峰高之比為1∶1和1∶2，提示該羊水細胞在T1所在Xq13區域上基因有2個拷貝，在T3所在Xq21.1區域上，基因僅有1個拷貝。在達瑞生物非整倍體檢測試劑盒檢測結果中，C4所在SRY的檢測STR位點沒有擴增產物，說明為一女性標本，C1、C2、C3、C5 4個X-STR位點均為單峰，C6所在Xq13的STR位點，有1個不平衡雙峰出現，提示在Xq13區帶上的基因可能存在2個拷貝，其他區域基因僅有1個拷貝。為尋找更多X染色體上STRs位點信息，我們利用無錫中德美聯AGCU 19X-STR多重熒光復合擴增試劑盒檢測，結果在DXS10159、DXS10164、DXS10162、DXS10079、DXS10074等5個位點上有不平衡雙峰，而其余14個X-STRs位點均為單峰，我們推測，在此5個STR所分布的著絲粒和Xq12區域上，基因有2個拷貝，而之外的區域，基因僅有1個拷貝。進一步羊水細胞培養后染色體核型分析發現，該羊水標本細胞核型為46，X，+mar［33］/45，X［67］，為嵌合型核型，因此結合STRs檢測結果我們最終推論，該羊水細胞丟失一條X染色體，此條染色體僅殘留著絲粒至q13區域，形成46，X，+mar與45，X兩種核型的嵌合，因而大部分X-STRs為單峰，而在著絲粒至Xq13區域的STRs有雙峰出現。

與傳統核型分析方法比較，QF-PCR法檢測STRs具有周期短、準確率高等優點［14］。但根據STR檢測原理，其對染色體數目異常嵌合體和染色體結構的異常不敏感，常檢測不到異常位點，容易導致漏診，在僅一個或兩個位點異常時，應考慮低比例數目異常嵌合的存在，此時應尋求更多STRs位點的信息綜合評估嵌合體存在的可能。傳統的染色體核型分析是目前診斷染色體病的金標準，對染色體異常具有最直接、準確的判斷，是指導臨床遺傳咨詢的依據之一［15-17］，借助傳統的細胞核型分析，可明確嵌合體的診斷及嵌合比例。

在臨床檢測中，結合STR位點分析與染色體核型分析，可為嵌合體核型提供更多的遺傳數據作為遺傳學分析的證據［18-21］。

此案例中45，X核型占67%，X染色體殘留mar核型占33%，QF檢測X染色體區域出現1個位點可疑雙峰，此時染色體微陣列檢測可能出現X染色體信號減弱、或者信號難以判斷的情況，為此可利用其他檢測方法以尋求更多遺傳學信息。AGCU 19XSTR多重熒光復合擴增試劑盒是檢測X染色體上STR位點的檢測系統，可判斷X染色體上基因的拷貝數。本研究中，45，X為主要羊水細胞染色體核型，低比例核型有不明來源的片段。QF出現單個X位點兩個拷貝的可疑信號，因此，我們選擇AGCU 19X-STR多重熒光復合擴增試劑盒對此樣本X染色體STR位點進行檢測分析，發現Xq13區域的STRs有雙峰信號，說明此區域基因有兩個拷貝。綜合分析推斷，一條X染色體殘留片段可能以mar形式存在，因而出現46，X，+mar［33］/45，X［67］的核型表現，而QF、STRs檢測部分區域基因出現兩個拷貝的雙峰型，此標本的各項遺傳學檢測結果可相互解釋映證。

綜上所述，唐篩18三體高風險孕婦產前羊水細胞X染色體部分缺失，絲粒至q13區域保存，羊水細胞染色體核型為46，X，+mar［33］/45，X［67］，胎兒為嵌合體。QF-PCR法檢測STRs聯合傳統核型分析可對嵌合型染色體數目異常提供診斷支持，為臨床產前診斷提供支持。