卵巢癌組織中酰胺核苷酸反義轉氫酶RNA1表達觀察及患者預后影響因素分析

李俊蘭，陳歡，李瑤

湘南學院附屬醫院婦科，湖南郴州 423000

卵巢癌是女性生殖系統的常見惡性腫瘤。上皮性卵巢癌是最常見的卵巢癌類型，占所有卵巢癌的90%，多數上皮性卵巢癌患者確診時處于Ⅲ期或Ⅳ期，5年生存率僅為42%、26%［1］。雖然近年來手術、新輔助放化療、靶向治療技術不斷提高，但是卵巢癌的療效有限，腫瘤切除術后復發率仍然居高不下，患者生存率依然較低。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一類長度＞200 nt，缺乏閱讀編碼框的RNA，在細胞周期調控、表觀遺傳、mRNA降解翻譯調控等方面發揮作用，參與腫瘤的生長和轉移，已被研究證明是惡性腫瘤診斷生物標志物和治療的潛在靶點［2］。煙酰胺核苷酸反義轉氫酶RNA1（nicotinamide nucleotide transhydrogenase-anti sense RNA1，NNT-AS1）是一種新發現的細胞質LncRNA，可通過調控miRNA的表達影響細胞增殖及凋亡。研究［3］發現，NNT-AS1在肺癌、肝癌等多數惡性腫瘤組織中異常高表達，但在胃癌、乳腺癌、卵巢癌組織中低表達。目前NNT-AS1在卵巢癌的臨床特點和意義尚不清楚。本研究檢測了卵巢癌癌組織NNT-AS1表達，分析卵巢癌患者預后的影響因素，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月－2017年11月間我院婦科收治的卵巢癌患者82例。納入標準：①均行腹腔鏡卵巢癌切除手術或腫瘤細胞減滅術，經術后病理組織學證實為上皮性卵巢癌；②術前未接受任何形式治療；③臨床檢測資料和術后大體組織病理學結果完整。排除標準：①良性卵巢腫瘤或合并其它部位惡性腫瘤；②發生遠處轉移，不具備手術指征；③隨訪失聯。患者年齡41～72歲，其中＜60歲35例、≥60歲47例；腫瘤直徑＞3 cm者45例，≤3 cm者37例；腫瘤分化程度為低、中度分化51例，高度分化31例；國際婦產科聯盟（FIGO）分期為Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期49例；血清癌胚抗原（CA125）≥200 U/mL者50例，CA125＜200 U/mL者32例；雌激素受體α受體（ERα）陽性59例。本研究經我院醫學倫理委員會批準同意，納入患者或其家屬知情同意。

1.2 卵巢癌組織及癌旁組織NNT-AS1檢測 82例患者術中均留取卵巢癌組織及癌旁組織（距腫瘤組織邊緣≥5 cm）標本，剪成1 mm3加入RNA保護液液氮冷凍保存備用。液氮預冷研缽，磨成粉末，加入TRIzol RNA提取試劑（美國Thermo Fisher公司）參照說明書分步提取組織RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選取吸光度260/280比值位于1.9～2.1的RNA，M-MLV逆轉錄酶（Epicentre公司）將RNA逆轉錄為cDNA。取2μl cDNA樣品加入實時熒光定量聚合鏈反應（qRT-PCR）體系，采用CFX96實時熒光PCR儀（美國Bio-Rad）運用qRT-PCR檢測NNT-AS1表達。引物合成及序列測定由上海基康公司完成。NNT-AS1上游引物5′-TGAAGTTTTCAGGGACACAT-3′，下游引物5′-TTTAGACCTGTTTCTTTGTT-3′；以GAPDH為內參，上游引物5′-TGTACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，40個循環。反應體系：SYBR?Premix Ex Taq?II（2×）12.5μL，dNTP 1.6μL，Taq DNA聚合酶1μL，上下游引物10μmol/L各1μL，加反應緩沖液至25μL。75℃讀取熒光，構建溶解曲線。以GAPDH RNA為內參，以2-ΔΔCt代表NNT-AS1的相對表達量，共做3次平行試驗，取平均值。

1.3 預后隨訪方法 82例患者出院后采用電話或者門診等方式定期隨訪，每2個月隨訪1次，統計隨訪期間患者腫瘤復發轉移、死亡情況，隨訪截至2020年11月，記錄患者無進展生存期（Progressionfree survival，PFS）、總生存期（Overall survival，OS）。PFS定義為自接受手術日期至腫瘤復發、轉移、全因死亡或隨訪結束時間，OS定義為接受手術日期到因任何原因引起的死亡或隨訪結束時間。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.00統計軟件進行數據處理。采用Kolmogorov-Smirnov法對計量資料進行擬合優度檢驗，符合正態分布的計量資料以，表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。Kaplan-Meier法繪制不同NNT-AS1表達的卵巢癌患者PFS、OS生存曲線，采用Log-Rank檢驗差異性；以卵巢癌患者隨訪期間預后生存情況為因變量（1=死亡，0=存活，t=生存期），納入年齡（賦值：連續性變量）、腫瘤大小（賦值：1=≤3 cm，2=＞3 cm）、分化程度（賦值：1=高度分化，2=低中度分化）、FIGO分期（賦值：1=Ⅰ～Ⅱ期，2=Ⅲ～Ⅳ期）、CA125（賦值：1=CA125＜200 U/mL，2=CA125≥200 U/mL）、ERα（賦值：1=陰性，2=陽性）、NNT-AS1（賦 值：1=NNT-AS1≥0.53，2=NNT-AS1＜0.53）為自變量，采用單因素和多因素Cox比例風險模型分析卵巢癌患者預后的影響因素。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌及癌旁組織NNT-AS1相對表達量比較 卵巢癌及癌旁組織NNT-AS1相對表達量分別為0.53±0.19、1.52±0.36，二者比較，P＜0.05。

2.2 不同臨床病理特征的卵巢癌患者癌組織NNTAS1表達比較 不同臨床病理特征的卵巢癌患者癌組織NNT-AS1表達見表1。低中度分化、Ⅲ～Ⅳ期、CA125≥200 U/mL、ERα陽性患者NNT-AS1表達低于高度分化、Ⅰ～Ⅱ期、CA125＜200 U/mL、ERα陰性患者（P＜0.05）。

表1 不同臨床病理特征的卵巢癌患者癌組織NNT-AS1表達（±s）

表1 不同臨床病理特征的卵巢癌患者癌組織NNT-AS1表達（±s）

臨床病理特征年齡≥60歲＜60歲腫瘤直徑＞3 cm≤3 cm腫瘤分化程度高度分化低中度分化FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期血清CA125水平≥200 U/mL＜200 U/mL ERα陽性陰性n 47 35 45 37 31 51 33 49 50 32 59 23 NNT-AS1 0.54±0.17 0.52±0.18 0.54±0.18 0.52±0.17 0.69±0.03 0.43±0.07 0.63±0.05 0.46±0.08 0.48±0.09 0.61±0.10 0.47±0.06 0.68±0.04

2.3 不同NNT-AS1表達的卵巢癌患者PFS生存率、OS生存率比較 本次隨訪期間無失訪患者，隨訪期間復發8例、遠處轉移5例、病死35例。根據NNT-AS1表達均值將患者分為NNT-AS1高表達（NNT-AS1≥0.53）39例和NNT-AS1低表達（NNTAS1＜0.53）43例。NNT-AS1低表達者PFS生存率、OS生存率分別為27.91%（12/43）、39.53%（17/43），NNT-AS1高表達者分別為56.41%（22/39）、76.92%（30/39），二者比較，P均＜0.05。不同PFS、OS的卵巢癌患者Kaplan-Meier生存曲線見圖1。

圖1 不同PFS、OS的卵巢癌患者Kaplan-Meier生存曲線

2.4 卵巢癌患者預后的影響因素 卵巢癌患者預后的單因素Cox比例風險回歸分析結果見表2。卵巢癌患者預后的多因素Cox比例風險回歸分析結果見表3。

表2 卵巢癌患者預后的單因素Cox比例風險回歸分析結果

表3 卵巢癌患者預后的多因素Cox比例風險回歸結果

3 討論

卵巢癌發病率僅占女性惡性腫瘤的2.5%，但病死率占5%［1］，我國卵巢癌發病率和死亡率也呈上升趨勢［4］。由于卵巢組織結構和內分泌功能復雜，腫瘤早期缺乏典型臨床癥狀，確診時多數已經發現轉移，喪失最佳手術時機，遠期生存率不容樂觀。因此探討與卵巢癌相關的分子生物學標志物對臨床診斷、指導治療、預后評估均有重要意義。

LncRNA是缺乏或無開放閱讀編碼框的具有更高組織特異性的RNA，人類LncRNA種類約超過6萬，LncRNA多數定位于細胞核，少數在細胞質，主要通過順式或反式調控靶基因表達。LncRNA由RNA聚合酶Ⅱ催化轉錄而來，無編碼蛋白質功能，在組織和細胞中有較強特異性，參與轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸調控［5］。LncRNA通過影響下游啟動子轉錄、染色質重組、與特定蛋白質結合等影響細胞信號傳導，調節人體絕大多數生理病理過程。LncRNA表達異常可導致其調控的蛋白或核酸功能障礙。LncRNA參與腫瘤細胞的增殖凋亡、上皮間質轉化、抗腫瘤藥物耐藥等機制［6］。LncRNA在卵巢癌的發病中發揮重要作用［7］。GAS5與卵巢癌細胞的增殖以及順鉑耐藥有關［8］，HOTTIP則通過上調中性粒細胞中PD-L1表達，抑制T細胞活性，導致卵巢癌細胞免疫逃逸［9］。

NNT-AS1定位于人類5號染色體，通過與miRNA競爭影響多種信號通路調控大量下游基因表達參與惡性腫瘤發生和發展。現有研究［10］顯示，NNTAS1在肺癌組織呈高表達，可調控miR-3666/E2F轉錄因子2信號通路，促進癌細胞的增殖、侵襲。NNTAS1在膀胱癌組織和細胞系中表達上調，NNT-AS1高表達與晚期臨床分期、淋巴結轉移和較短的總生存期顯著相關，NNT-AS1可能通過miR-496/高遷移率族蛋白1信號通路在膀胱癌發病機制中發揮促癌基因作用［11］。但也有報道［12］顯示NNT-AS1在胃癌中表達下調，且與淋巴、血管侵犯有關。本研究結果發現，乳腺癌組織中NNT-AS1呈低表達，ERα陰性的患者癌組織NNT-AS1表達高于陽性組織，提示NNT-AS1表達可能與性激素受體有關［13］。NNT-AS1在卵巢癌組織中呈低度表達，與文獻［10-11］所述相反，與［12-13］描述一致，提示NNT-AS1在不同惡性腫瘤中作用機制不同。

進一步分析NNT-AS1表達與卵巢癌患者臨床病理特征的關系發現，NNT-AS1表達與FIGO分期、CA125水平、分化程度有關，提示NNT-AS1表達缺失可能與卵巢癌高惡性程度、增殖侵襲和轉移惡性生物學行為有關，在卵巢癌中NNT-AS1可能發揮抑癌基因作用。HUANG等［14］發現NNT-AS1在卵巢癌表達下調，敲除NNT-AS1后，卵巢癌細胞增殖和侵襲能力增加60%和70%。體外研究顯示沉默NNTAS1，卵巢癌細胞增殖活性增高，細胞凋亡率下降，侵襲能力提高，NNT-AS1可能通過抑制內源性途徑調控卵巢癌發生和發展［15］。

NNT-AS1如何參與卵巢癌發病機制尚不清楚，現有研究顯示雌激素對卵巢上皮細胞具有基因轉錄活性調節和促進其有絲分裂的作用，ERα在卵巢癌中異常表達與卵巢癌發病、預后及對化療反應均有關［16］。在ERα受體陽性卵巢癌細胞中，雌激素水平升高可導致LncRNA功能障礙以及其調控的蛋白表達異常，引起卵巢癌細胞的浸潤和轉移［17］。在ERα陽性的乳腺癌細胞中，給予雌激素刺激可引起miR-424和 轉 錄 因子E2F1表達升高［18］，而NNT-AS1是miR-424/轉錄因子E2F1軸上游調節因子［19］，提示NNT-AS1/miR-424/轉錄因子E2F1軸可能調控ERα表達。

本研究結果也顯示ERα陽性組NNT-AS1表達低于ERα陰性組，提示NNT-AS1可能通過調控ERα表達參與卵巢癌發病和進展，但是具體機制仍不清楚。雖然目前證據尚不足以證實NNT-AS1與卵巢癌發病之間的直接因果關系，但仍提示NNT-AS1低表達與性激素相關的腫瘤進展有關。通過隨訪調查發現，NNT-AS1低表達者PFS生存率和OS生存率低于高表達者，回歸分析示NNT-AS1低表達是卵巢癌預后不良的危險因素，可能與NNT-AS1低表達促使卵巢癌細胞增殖、侵襲、轉移，導致腫瘤復發有關，提示NNT-AS1可以作為判斷患者預后情況的一項指標。

綜上所述，卵巢癌組織中NNT-AS1呈低表達，NNT-AS1表達與卵巢癌分化程度、FIGO分期、ERα、血清CA125水平有關，NNT-AS1低表達是卵巢癌預后不良的危險因素。NNT-AS1有望作為卵巢癌預后預測的潛在標志物和治療的潛在靶點。