超聲引導下腔內注射雷公藤甲素納米粒治療兔類風濕關節炎的實驗研究

林嬌嬌 蘇立陽 曾雅婷 羅瑋雯 李拾林

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕性關節炎為主要臨床表現的慢性自身免疫性疾病，部分患者以寡關節受累為主，全身用藥效果欠佳，關節腔內注射給藥是常用的臨床治療手段，在減輕全身副作用的同時又能保證局部達到有效藥物濃度。雷公藤甲素（triptolide，TP）是雷公藤木質部提取的二萜類脂溶性化合物，具有抗炎、抗腫瘤及免疫調節等作用，可用于RA的治療［1］。但TP治療RA的生物利用度低，為達到療效臨床常增加劑量，致伴隨的副作用風險也增加［2］。納米粒在實現藥物靶向遞送的同時，還可以提高藥物的生物利用度。本研究以固體脂質納米粒作為載藥工具制成TP納米粒（triptolide nanoparticle，TPN），于超聲引導下兔膝關節腔內注射TPN治療兔抗原誘導關節炎（antigen-induced arthritis，AIA），并評估其療效，旨在探討其臨床價值。

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材料與方法

一、實驗動物

選取成年健康新西蘭大白兔27只，體質量2.3～2.7 kg，購自福建省連江玉華山自然生態農業試驗場，許可證號：SCXK（閩）2014-0001，分籠飼養于泉州醫學高等專科學校動物房恒溫（24～26℃）環境中。

二、主要實驗試劑及儀器

1.主要試劑：TP（純度＞99%，北京百靈威科技有限公司）；倍他米松（BS，瑞士Mreck Sharp&Dohme AG公司）；完全弗氏佐劑、卵蛋白（美國Sigma公司）；山崳酸甘油酯、甘油棕櫚酸硬脂酸酯（國藥集團化學試劑有限公司）；單硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯40醚氫化蓖麻油（山東優索化工科技有限公司）；棕櫚酸（青島優索化工科技有限公司）。

2.主要儀器：日立Preirus彩色多普勒超聲診斷儀，線陣探頭，頻率為18 MHz；Nano-ZS90 Zetasizer激光粒度儀（英國Malvern公司）；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器（河南省鞏義市予華儀器有限責任公司）；全自動生化分析儀（德國Beckman公司）。

三、實驗方法

1.兔膝關節滑膜炎病理評分比較：TP組滑膜炎病理評分（5分）低于對照組（10分），差異有統計學意義（Z=-2.530，P＜0.05），以輕度滑膜炎為主；TPN組和BS組滑膜炎病理評分（1分、0分）均低于TP組，差異均有統計學意義（Z=-2.082、-2.687，均P＜0.05），TPN組與BS組比較差異無統計學意義。見圖2 A1～A3。

2.建立AIA兔動物模型：分為基礎致敏和末次免疫兩個環節。基礎致敏：先將20 mg/ml卵蛋白生理鹽水與等量完全弗氏佐劑混勻，現配現用，每只兔每周于肩胛區皮下注射混合液1.0 ml，連續注射3周；末次免疫：于第4周向兔膝關節腔內注射0.2 ml卵蛋白溶液［4］。末次免疫1周后行超聲檢查提示膝關節滑膜組織增生明顯及滑膜血流信號較豐富，即為模型建立成功。

3.分組及超聲引導下腔內注射：27只兔隨機分成4組，在末次免疫1周后，取2%戊巴比妥鈉（1.25 ml/kg）注入兔耳緣靜脈麻醉后，90°屈曲兔膝關節，TPN組、TP組和BS組（各7只）分別于超聲引導下使用1.0 ml注射器向兔膝關節腔內注射TPN、TP、BS溶液各0.2 ml，其中TP溶液和TPN溶液中TP含量均為0.1 mg/ml，連續給藥4周，每周1次。對照組（6只）僅行關節腔穿刺而不注射任何藥物。

四、觀測指標

1.各組兔膝關節滑膜增生超聲評分比較：末次給藥1周后對照組滑膜增生超聲評分以2、3分為主，TP組以1、2分為主，BS組和TPN組以0、1分為主，見表2和圖1 A1～A4。TP組滑膜增生超聲評分低于對照組（Z=-2.726，P＜0.05），BS組和TPN組滑膜增生超聲評分均低于TP組，差異均有統計學意義（Z=-2.176、-2.360，均P＜0.05），BS組與TPN組比較差異無統計學意義。

在此基礎上，1984年8月，我國第一個物流專業研究團體——中國物流研究會成立。1989年4月，由中國物資經濟學會承辦的第一個國際物流會議——第八屆國際物流會議在北京舉辦。據描述：這樣的國際物流會議是第一次在中國舉辦。

表1 Szkudlarek超聲評分標準

五、統計學處理

企業外宣翻譯一方面要客觀、真實、準確地反映產品質量特征;另一方面，要跨越目的語與源語之間存在的語言文化差異，運用變通的翻譯方法，拉近與目的語讀者的心理距離，使他們最大限度地產生對產品的認同感，才能達到積極良好的宣傳效果，吸引更多的潛在客戶。例4原文中列舉了企業獲得的許多權威認證來凸顯企業的質量優勢，是典型的“第一人稱視角”，這種做法在西方人看來卻有重復自夸的嫌疑，效果可能適得其反。譯文取質量、效率和顧客滿意度三點，簡化翻譯，更能實現宣傳功能。

結 果

一、各組兔總體情況

2.兔膝關節骨侵蝕病理評分比較：TP組、TPN組和BS組骨侵蝕病理評分（2分、1分、1分）均較對照組低（10分），差異均有統計學意義（Z=-2.216、-2.505、-2.505，均P＜0.05），TP組、TPN組和BS組間的比較差異無統計學意義。見圖2 B1～B3。

二、各組兔膝關節的超聲評分比較

關節腔內連續給藥4周，觀察各組兔一般情況，測量其膝關節直徑。每周行膝關節超聲檢查，根據Szkudlarek超聲評分系統［5］對各組兔膝關節的滑膜增生、滑膜血流信號及骨侵蝕情況進行評分，評分標準見表1。在末次給藥的1周后取耳緣靜脈血，行生化全套檢測，測量指標包括：總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、血清尿素氮（BUN）及血清肌酐（Scr），比較各組兔肝、腎功能的差異。然后經耳緣靜脈使用空氣栓塞法處死兔，取兔膝關節制作病理切片并行HE染色，觀察滑膜增生和骨侵蝕情況并進行病理評分，滑膜增生（滑膜炎）的病理評分根據Krenn評分標準［6］，以滑膜襯里層、滑膜細胞的數量、炎癥浸潤程度3個指標分為無、輕度、重度滑膜炎；同時取所有兔的肝、腎進行病理檢查。

表2 末次給藥1周后各組膝關節滑膜增生的超聲評分結果 只

大學生群體是充滿活力、積極向上、斗志昂揚的知識分子群體。思政工作者要將話語策略充分運用到育人工作中，增強其對學生的文化涵養作用，根據不同的大學生群體采用不同的話語技巧與言語表達藝術，讓學生樂于接受勵志教育并化為踐行的力量，從而培養出具有深厚人文主義情懷的杰出青年，為社會進步貢獻自己的力量。

2.各組兔膝關節滑膜血流超聲評分比較：末次給藥1周后TP組、TPN組和BS組滑膜血流超聲評分以0分為主，均較對照組低，差異均有統計學意義（Z=-3.033、-2.842、-3.277，均P＜0.01）；TP組、TPN組和BS組間比較差異無統計學意義。見表3和圖1 B1～B4。

表3 末次給藥1周后各組膝關節滑膜血流的超聲評分結果 只

3.各組兔膝關節骨侵蝕超聲評分比較：末次給藥1周后TP組、TPN組和BS組的骨侵蝕超聲評分以0分和1分為主，均較對照組低，差異均有統計學意義（Z=-2.948、-3.141、-3.210，均P＜0.01）；TP組、TPN組和BS組間比較差異無統計學意義。見表4和圖1 C1～C4。

表4 末次給藥1周后各組膝關節聲骨侵蝕的超聲評分結果 只

圖1 各組兔膝關節超聲表現

三、各組兔膝關節的病理評分比較

1.制備TPN：參考文獻［3］，采用微乳法將TP、酯類等原材料放在集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中加熱熔融并磁力攪拌，然后緩慢滴加超純水，待形成有淡藍色乳光的微乳后，繼續磁力攪拌，迅速用4℃冰水冷卻固化，磁力攪拌100 min，樣品置于冰箱4℃保存。

所有兔在末次免疫后的第2天均出現膝關節腫脹皮溫升高，行走受限；在注射給藥1周后，TPN組、BS組和TP組兔膝關節直徑均明顯減小。所有兔一般情況可，體質量均未見明顯減輕，末次給藥1周后血生化檢查提示各組TBIL、IBIL、DBIL、AST、ALT、BUN及Scr均無明顯異常。所有兔肝、腎病理檢查均提示肝、腎細胞形態正常，排列良好，未發現異常改變。

教師要借助“一題多解”引導學生全面地分析問題、多角度地審視問題，幫助學生形成良好的思維習慣。學生的思維具有發散性，會不拘泥于一種途徑、一種方法，教師要通過情境的創設鼓勵學生從不同角度、不同方向去思考問題。當學生的思維遇到障礙時，教師還要有意識地引導學生從反方向去思考問題，探求出新思路、新方法。

圖2 各組膝關節滑膜和骨病理圖（HE染色，×40）

四、相關性分析

兔膝關節滑膜增生超聲評分和骨侵蝕超聲評分與其病理評分均呈正相關（r=0.832、0.859，均P＜0.001）。

討 論

目前認為RA的免疫發病機制是在基因和環境共同影響下，自身免疫被激活，自身反應性T細胞分化為致病性T細胞亞群，在一系列免疫調節細胞和細胞因子的共同作用下，引發炎癥級聯反應，最終導致關節炎［7］。TP是中藥雷公藤的主要活性成分，其可以通過誘導致病性T細胞凋亡、衰減核內轉錄因子NF-κB活性和降低促炎細胞因子水平等改善滑膜炎癥、減輕骨破壞，同時還可抑制RA血管翳生成［8］。本實驗結果發現兔關節腔內注射TP后膝關節滑膜炎和骨破壞情況均明顯改善，說明腔內注射TP治療RA有一定療效。

使用中草藥治療疾病最大的挑戰是吸收不良、生物利用度低，常需要增加劑量才能達到理想療效，但伴隨的副作用風險也隨之升高［2］。隨著納米技術的發展，納米粒在提高藥物生物利用度的同時還可以實現藥物的靶向遞送，被廣泛應用于載藥系統。研究［9］指出納米藥物可以選擇性地將藥物遞送并保留在發炎的滑膜組織中，利于藥物吸收，同時減少全身潛在副作用。且脂質納米粒的生物相容性好，能有效提高TP的生物利用度，實現緩釋控釋，同時保護TP不被關節腔內的酶類降解，從而減少劑量依賴性毒性［10］。最近研究［11］表明，肽修飾的脂質體遞送可以調節免疫細胞因子，提高自身免疫性關節炎的治療指數，增強療效的同時降低了全身性暴露風險［12］。目前局部治療RA最常用的藥物是糖皮質激素，其能迅速減輕疼痛，有效控制炎癥，但后期復發率高，易導致感染、骨質疏松等并發癥。已有研究［3］已證實采用微乳法制備TPN，包封率更高且能有效降低TP的亞急性毒性，具有良好的安全性，給藥4周后所有兔均未發現明顯肝、腎副作用。本實驗結果顯示，關節腔內注射TPN治療RA的效果明顯優于TP，效果與BS相當，TPN或可成為局部治療RA的備選藥物。

傳統的腔內注射進針方法主要是靠關節表面的骨性標志結合觸診來定位，具有盲目性。本實驗使用超聲引導下腔內注射給藥，所有兔均未出現穿刺并發癥等情況。相比其他影像引導技術，超聲引導因無輻射且能夠實時調整穿刺路徑及走向，使針尖準確位于關節間隙內，從而避開周圍血管、肌腱和神經等，減少穿刺損傷，確保藥物進入關節腔。研究［13］認為肌骨超聲對RA病理特征的評價效能與MRI相當，且超聲觀測滑膜血流信號與C反應蛋白、紅細胞沉降率、類風濕因子均呈正相關（r=0.623、0.498、0.591，均P＜0.05），有助于評估疾病的活動性。鄭擎等［4］應用高頻超聲于末次免疫后1周內檢測到AIA模型兔關節滑膜增厚，本實驗結果與之相符，早于血清中的血管內皮生長因子和TNF-α明顯上升時間（2～6周），可見超聲早期診斷RA的敏感性更高。研究［14］發現超聲檢查結果較疾病活動的血清學指標與組織學評分相關性更好，尤其是在疾病早期階段。本實驗兔AIA模型在末次免疫后第2天兔膝關節均出現明顯腫脹，超聲檢查下可見滑膜增生并隨時間逐漸進展，滑膜血流較豐富，4周后開始出現骨破壞。在注射藥物治療后，除對照組外其他各組兔膝關節滑膜炎及骨侵蝕情況均有明顯好轉，且滑膜炎和骨侵蝕的超聲評分與病理評分均具有良好的相關性（r=0.832、0.859，均P＜0.001）。由此可見超聲檢查評估RA患者關節炎情況準確可靠，可以用于關節炎的早期診斷和療效監測中。

在臨床上，糖尿病是一種常見的多發病，其中以2型糖尿病最為多見，占比約為95%左右。針對此類患者，臨床單獨采用胰島素加以治療時，無法有效控制其血糖水平[1]。而作為一種噻唑烷二酮類降糖口服藥，吡格列酮可保護胰島β細胞，且可增加胰島素敏感性，因而可發揮有效的血糖控制效果[2]。因此本文隨機抽取我院收治的80例糖尿病患者，隨機分為2組，各40例，即對糖尿病采用二甲雙胍與吡格列酮聯合治療的臨床價值做了探討，現報道如下。

本實驗的局限性：①納入的兔AIA模型樣本量相對較少，后期還需進行更大樣本的研究，以及關節腔內藥物代謝動力學的研究；②本實驗僅觀察至給藥4周后，未進行長期療效對比。

綜上所述，對于寡關節受累的兔AIA，超聲引導下關節腔內注射TP或可成為治療關節炎的新方法，尤以TPN療效更顯著；超聲在評價滑膜炎與骨侵蝕情況上與病理檢查均具有較好的一致性，可作為評估早期關節炎及隨訪治療效果可靠的影像學手段。