原發性肺黏液腺癌與非黏液性肺腺癌病例對照研究

汪海波 李鴻茹 黃藝 鄭冬美 潘軍帆 許能鑾

福建醫科大學省立臨床醫學院,福州 350001

肺癌已經成為全球最大殺手,根據2018年全球癌癥數據庫,肺癌總體發病率和病死率均居世界首位,其中肺腺癌已成為肺癌最主要的組織學亞型[1],是肺部惡性腫瘤的研究重點和熱點。原發性肺黏液腺癌 (primary pulmonary mucinous adenocarcinoma,PPMA)是非小細胞肺癌 (nonsmall cell lung cancer,NSCLC)中肺腺癌的一種少見亞型,由Kish等[2]于1989年首次提出,國外報道大約占肺腺癌的0.14%[3]。PPMA 癌細胞分化程度高,惡性程度低。PPMA 早期常誤診為炎性病變、結核球和良性腫塊,其中炎性病變居多。氣道播散轉移是其肺內轉移的主要方式,不易遠處轉移,但也有顱腦轉移[4]、睪丸轉移[5]、口腔轉移[6]的個案報道。因此,增加對PPMA 的認識,早期鑒別和早期診斷,對其預后改善尤為重要。本研究回顧性分析福建省立醫院收治的術后PPMA患者,通過與非黏液性肺腺癌(對照組)比較,總結PPMA 的臨床特征及預后情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性研究。2013年1月至2019年6月福建省立醫院經術后病理確診PPMA 共54例,男22例,女32例,男女比例為1∶1.45,年齡范圍為38～76歲,平均年齡(57.0±10.0)歲。中位確診時長2.5個月。對照組按照1∶2比例,選取同時期術后確診為非黏液性肺腺癌患者108例。男46例,女62例,年齡范圍為26～79歲,平均年齡(58.0±11.0)歲。納入標準:經手術獲取標本,病理確診為PPMA 且隨訪資料完整。排除繼發于消化系統或其他部位的黏液腺癌、合并活動性肺結核、伴其他嚴重系統疾病、確診前已知合并其他肺部以外惡性腫瘤。采用回顧性調查方法,查閱并收集病例資料,記錄患者的一般情況,如姓名、性別、年齡、個人史、腫瘤家族史、住院時長、確診時長、臨床表現、腫瘤標記物、影像表現、病理、免疫組織化學、基因突變檢測以及治療方案等。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2 治療情況 所有患者接受手術治療,行肺癌標準根治術 (肺葉切除+系統性淋巴結清掃)42例(77.8%),有30例手術后出現并發癥,主要為肺部感染、胸腔積液、皮下氣腫、氣胸等。行術后化療20例(37.0%),主要化療方案有:卡鉑/順鉑+培美曲塞15例 (27.8%)、卡鉑/順鉑+紫杉醇1 例 (1.9%)、卡 鉑/順 鉑+ 安 素 泰3 例(5.6%)、順鉑+吉西他濱1例 (1.9%),所有化療方案均含鉑類。行術后放療4例,其中1例因手術后2年出現雙肺及骨轉移,行骨轉移病灶局部放療,放療2個月后死于呼吸衰竭;1例為ⅢA 期化療后聯合放療,截至隨訪時間未見腫瘤復發;1例為Ⅱ期化療后聯合放療,放療期間出現3度骨髓抑制而終止放療,2年后腫瘤局部復發;1例因手術后4年出現腦轉移,予顱腦姑息放療,放療半年后腦轉移灶消失,截至隨訪時間患者沒有出現腫瘤復發。表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突變檢測 (組織PCR 法)陽性率為10.5% (4/38),突變位點均為21號外顯子L858R 突變,2 例口服 “吉非替尼 (易瑞沙)250 mg,1次/d”治療,其中1例因手術后2年發現縱隔淋巴結轉移,開始口服易瑞沙,截至隨訪時間患者病情評估為疾病穩定 (stable disease,SD);另1例因手術后2年出現雙肺及骨轉移,開始口服易瑞沙治療,靶向治療2個月后死于呼吸衰竭。動物微管相關蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因檢測(組織PCR 法)陽性率20.0% (3/15),其中1例因分期晚,于手術后即開始口服“克唑替尼250 mg,2 次/d”,靶向治療1 年后出現耐藥,開始規律予含吉西他濱方案化療,截至隨訪時間患者沒有出現腫瘤進展;其他2例至今未復發,未服用相關靶向藥物。

1.3 研究方法

1.3.1 病理檢查 切除組織標本均經10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,切片厚度4μm,HE 染色,光鏡觀察。PPMA 包括肺原位黏液型腺癌、肺微浸潤黏液型腺癌、肺浸潤性黏液腺癌(pulmonary invasive mucinous adenocarcinoma,PIMA)、實體為主伴黏液分泌型腺癌及膠樣癌。其中PIMA 根據黏液成分與非黏液成分所占比分為單純型與混合型。單純型肺浸潤性黏液腺癌定義為腫瘤細胞呈鱗屑樣生長,其黏液成分>90%的浸潤性黏液腺癌。肺浸潤性黏液/非黏液混合型腺癌定義為肺浸潤性黏液腺癌中混有貼壁生長型、腺泡型、乳頭型和微乳頭型等非黏液腺癌成分,且非黏液腺癌成分≥10%非黏液成分的組織類型[7]。54例PPMA 患者中單純PIMA 患者26 例,混合型PIMA 患者26例,膠樣癌2例,因膠樣癌樣本量少不納入本研究。

1.3.2 免疫組織化學 免疫組織化學染色采用En Vision兩步法,具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行,每張切片均設陽、陰性對照。一抗、二抗和SP檢測試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。結果判定采用組織學評分法評估,按照各自染色程度和染色細胞數進行綜合量化分析評分。

1.4 隨訪 隨訪從手術治療第1天開始計算,所有患者均隨訪截止2019 年8 月16 日。全組隨訪162例,隨訪2～77 個月,中位隨訪期17 個月,沒有失訪。復發定義為從手術治療后原手術部位再次出現病灶或在其他部位形成與原發部位腫瘤相同類型的腫瘤。復發時間定義為從手術時間至第1次確定復發病灶的時間。無病生存期 (disease-free survival,DFS)定義為從手術時間至術后第1 次隨訪出現復發證據的時間。總生存期 (overall survival,OS)定義為從手術時間至死亡的時間或隨訪結束時間。

1.5 統計學方法 采用統計軟件SPSS 23.0進行分析,定量資料若為正態分布,用±s表示,組間比較采用t檢驗;非正態分布資料用中位數和四分位數[M(P25,P75)]表示,組間比較使用非參數檢驗Mann-WhitneyU檢驗。等級資料采用Wilcoxon秩和檢驗;計數資料采用例 (%)表示,組間比較采用χ2檢驗。將單因素分析中P<0.05的相關因素應用二元Logistic 回歸分析,根據Logistic回歸分析的結果參數建立PPMA 預測模型公式,并對PPMA 預測模型的預測能力使用ROC 曲線分析評價。 生存分析采用繪制Kaplan-Meier生存時間曲線,以Log-Rank檢驗為標準。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基線資料 2組年齡、性別、手術方式、病理類型及TNM 分期基線資料差異均無統計學意義(P值均>0.05),具有可比性。見表1。

表1 2組患者基線資料比較

2.2 臨床特征比較 PPMA 組患者中位數確診時長較長(2.5個月),咳黏液痰發生率高 (16.7%,9/54),血清胃泌素釋放肽前體 (prosoma gastric secretin release peptide,Pro-GRP)異常率高(40.7%,22/54)。PPMA 患者腫瘤好發于雙肺下葉(50.0%,27/54),CT 表現為肺炎型發生率低(14.8%,8/54),支氣管充氣征、空泡征發生率高(37.0% 和18.5%,20/54 和10/54)。 再 者,PPMA 患者更容易出現被膜侵犯59.2% (32/54)、淋巴結轉移35.2% (19/54),EGFR 基因突變率11.1% (6/54)明顯較低。見表2。

2.3 免疫組織化學檢查比較 部分患者做了免疫組織化學檢測,PPMA 組TTF-1、Napsin A 陽性表達均明顯低于對照組 (P<0.01),見表3。PPMA 組Ki67表達情況與對照組比較差異無統計學意義,但亞組分析顯示與對照組比較,單純型PIMA 組及混合型PIMA 組Ki67陽性表達差異均有統計學意義(χ2=6.573,P=0.019)。見表4。

表2 2組患者臨床特征比較

表3 2組免疫組織化學結果比較 [例 (%)]

表4 PIMA 患者組織學亞型與對照組之間Ki67比較 [例 (%)]

2.4 PPMA 多因素分析及ROC 曲線分析 以確診時長、咳黏液痰、血清Pro-GRP、腫瘤位置、腫瘤形態、支氣管充氣征、空泡征、淋巴結轉移、被膜侵犯、TTF-1、Napsin A、EGFR 基因突變為自變量行多因素Logistic回歸分析。其中有咳黏液痰、血清Pro-GRP 異常、腫瘤位于雙肺下葉、腫瘤形態為結節腫塊型、有支氣管充氣征、有空泡征、有淋巴結轉移、有被膜侵犯、TTF-1 和Napsin A 陽性表達、EGFR 基因突變陽性定義為1。結果顯示咳黏液痰 (P=0.011)、CT 表現空泡征 (P=0.027)、被 膜 侵 犯 (P=0.004)、Napsin A (P=0.018)、EGFR 基因突變 (P<0.001)。其危險度分別為10.080 (1.688-60.199)、5.156 (1.206-22.044)、5.004 (1.669-15.003)、0.186 (0.046-0.750)、0.054 (0.013-0.231)。確診時長、血清Pro-GRP、腫瘤位于雙肺下葉、腫瘤形態、支氣管充氣征、淋巴結轉移、TTF-1 差異無統計學意義。見表5。

根據Logistic回歸分析,得出腺癌患者診斷為PPMA 預測模型公式:Logit(P)=2.311×咳黏液痰+1.640×空泡征+1.610×被膜侵犯-1.683×Napsin A-2.912×EGFR 基因突變。通過此模型得到每例腺癌患者診斷為PPMA 的預測概率,并利用ROC曲線評價該模型的預測能力 (圖1)。分析ROC曲線,顯示ROC 曲線下面積0.905,根據ROC曲線診斷標準,該模型的診斷準確性為較高。根據約登指數,當截斷界點為0.395時,其敏感度和特異度最大,分別為81.48%、86.11%。

表5 原發性肺黏液腺癌的多因素Logistic回歸分析結果

圖1 PPMA 預報能力的ROC曲線

2.5 預后比較 本研究PPMA 組有10 例(18.5%)復發,復發中位時間16個月,與對照組比較差異無統計學意義 (P>0.05)。生存分析結果顯示,PPMA 患者5 年無病生存率為74.3%,1、3、5 年 生 存 率 分 別 為96.3%、92.8%、92.8%,與對照組比較差異無統計學意義 (P>0.05)。亞組分析顯示單純型PIMA 患者5年無病生存率高于對照組與混合型PIMA 組。見表6、7,圖2。

圖2 PPMA 不同組織亞型與非黏液性肺腺癌患者DFS比較

表6 兩組預后比較

表7 PIMA 患者組織學亞型與對照組之間預后比較

3 討論

PPMA 臨床少見,早期預后較好,但由于臨床特征認識不足導致治療延誤、淋巴結轉移率高、EGFR 基因突變率低[8]等原因,導致一部分晚期PPMA 患者預后并不好[3]。因此,本研究以了解PPMA 臨床特征,并建立PPMA 的預測模型,促進對PPMA 的理解。

相比于非黏液性肺腺癌,本研究中54 例PPMA 患者從發現肺部影像異?；蛴信R床癥狀到確診的時間更長,考慮PPMA 相當一部分患者無明顯臨床癥狀,患者較晚就診所致。本研究咳黏液性痰可能是PPMA 的特異性表現。Popat等[9]研究表明由于PPMA 由含黏液的杯狀細胞及柱狀細胞組成,胞漿富含黏液,其癌細胞可以分泌大量黏液而致使肺泡內黏液明顯增多,因此可表現為長期反復咳白色泡沫樣黏液痰,此癥狀可以是其唯一的表現。也有學者認為當咳痰量>100 ml/24 h,就應考慮是否為肺黏液性腺癌的可能[10]。

Pro-GRP是一種神經內分泌源腫瘤標志物,Taira等[11]發現在NSCLC 患者伴神經內分泌特征時血清Pro-GRP 水平可以升高。本研究顯示PPMA 組患者Pro-GRP 升高率明顯高于非黏液性肺腺癌患者。陳國勤等[12]研究顯示其納入研究肺黏液腺癌患者嗜鉻粒素A (chromogranin A,Cg A)和突觸素 (synaptophysin,Syn)的陽性率分別為100%和71.4%,且陽性率均高于同組其他類型的腺癌。而Cg A 和Syn是神經性內分泌腫瘤的特異性標志物,為判斷腫瘤神經內分泌化可靠的指標[13]。因此,認為PPMA 患者血清Pro-GRP異常可能與PPMA 腫瘤細胞發生神經內分泌化有關。

本研究顯示PPMA 患者胸部CT 表現有一定特異性,主要表現為腫瘤好發于雙肺下葉,腫瘤形態以結節腫塊型多見,可見支氣管充氣征及空泡征。目前認為PPMA 更易發生于雙肺下葉,其原因可能與PPMA 起源于杯狀細胞有關。Sawada等[14]認為杯狀細胞分泌的黏蛋白用于支氣管黏膜纖毛的清除異物作用,因為長期吸煙或吸入空氣異物等刺激引起的細胞的增生與化生導致PPMA。當人在直立或睡覺時由于重力作用,雙肺下葉清除異物的作用比其他各肺葉更明顯,杯狀細胞更容易接受外界刺激從而增生與化生,因此PPMA 相比于其他類型腺癌更易發生于雙肺下葉。本研究認為支氣管充氣征可能是PPMA 的特征性表現。Oda等[15]認為由于PPMA 起源于杯狀細胞,腫瘤細胞生長迅速時,黏液分泌旺盛,導致黏液過量并聚集在肺泡及其周圍細小支氣管中,從而阻塞氣道,因此PPMA 相比非黏液肺腺癌更易出現支氣管充氣征。由于PPMA 腫瘤細胞沿肺泡壁、細支氣管生長,容易擠壓支氣管壁,所以PPMA 患者空氣支氣管征官腔多狹窄不規則、管壁不光滑,借此可與肺炎性實變鑒別[16]。本研究顯示PPMA 患者空泡征常見。Miyata等[17]認為PPMA 腫瘤細胞沿支氣管管壁浸潤性生長,易使管腔形成活瓣效應,由于氣體進入肺泡腔容易而排出困難,導致肺泡腔過度充氣形成空泡征,因此PPMA 患者空泡征常見。

本研究結果顯示PPMA 患者EGFR 基因突變陽性4例 (7.4%),全部為21號外顯子L858R突變,陽性率明顯低于對照組,與Hata等[8]報道相符。EGFR 基因突變陽性患者可以受益于靶向藥物治療,但容易出現耐藥。本研究PPMA 組有2例EGFR 基因突變陽性患者接受吉非替尼治療,1例治療2個月后疾病進展而死亡,考慮靶向藥物耐藥有關。Kobayashi等[18]認為耐藥的機制可能與瘤組織EGFR 基因發生了第二次突變有關,其突變的位點在第20號外顯子,即酪氨酸激酶活化域的790位蘇氨酸殘基被蛋氨酸替代,從而影響了EGFR-TKI預期靶點的結合。因此,可以發現PPMA 患者EGFR 突變率低,且對靶向藥物治療效果差。

黏液腺癌常見于胃腸道腫瘤,可轉移至肺部,因此在診斷PPMA 時應排除胃腸道腫瘤。Rossi等[3]研究顯示PPMA 與肺源性標志物TTF-1、CK7反應呈陽性,而消化道標志物CDX2、MUC2和CK20反應呈陰性,由此可鑒別PPMA 的原發部位。本研究結果顯示PPMA 患者TTF-1 和Napsin A 表達均明顯低于對照組,而兩組CK7表達差異無統計學意義。Lau等[19]認為Napsin A 主要表達于Ⅱ型肺泡上皮細胞和肺泡巨噬細胞,TTF-1由甲狀腺濾泡和濾泡旁c細胞、Ⅱ型肺細胞和肺的非纖毛細支氣管上皮 (clara細胞)選擇性表達,肺腺癌中含有黏液部分主要為杯狀細胞或產生粘蛋白的細胞,無黏液部分主要是Ⅱ型肺細胞或clara細胞分化,而TTF-1、Napsin A 在黏液成分中表達缺失。因此,含有黏液成分的PPMA 的TTF-1與Napsin A 陽性表達率低于非黏液腺癌,而CK7 在黏液成分中亦可表達,故CK7 表達在PPMA 與非黏液性腺癌之間差異無統計學意義。本研究顯示PPMA 組Ki67表達情況與對照組比較差異無統計學意義,但亞組分析顯示與對照組比較,單純型PIMA 組及混合型PIMA 組Ki67陽性表達差異均有統計學意義。Ki67是反應腫瘤細胞增殖標記物,表達于增殖細胞中,可以直接與反應腫瘤增殖的核抗原發生反應,在不同腫瘤類型中表達有差異。因此,提示黏液為主的腫瘤細胞增殖活性可能低于非黏液性腫瘤細胞。

本研究通過Logistic回歸分析建立PPMA 預測模型公式,發現肺腺癌患者如有咳黏液痰、胸部CT 可見空泡征、病理證實被膜侵犯、免疫組織化學Napsin A 低表達以及EGFR 基因突變陰性應高度懷疑PPMA。該模型有較高的靈敏度和特異度,因此可以有效協助PPMA 的早期發現,避免了誤診和漏診,達到早期治療PPMA,提高患者預后。

本研究結果顯示PPMA 組復發率為18.5%,中位復發時間為16個月,與對照組相比差異無統計學意義。目前認為PPMA 腫瘤復發考慮與腫瘤細胞通過氣道播散 (tumor spread through airspaces,STAS)有關[20],STAS是一種新的侵襲模式,當STAS 存在于肺段切除的肺葉中時,局部復發和遠處轉移率均顯著增加,因此預后不良。Warth等[21]研究顯示即使在體積較小的早期PIMA 中也可能發生STAS。Hwang等[22]研究證實術后復發與腫瘤內非黏液性浸潤結構的范圍、是否存在胸膜和血管侵犯有關。

本研究結果顯示PPMA 組與對照組總體預后差異無統計學意義,與Cai等[23]研究相符,但與Lee等[24]研究有所差異,考慮納入樣本人群的差異有關。本研究進一步亞組分析顯示單純型PIMA組預后好于對照組與混合型PIMA 組,這與Ki67表達情況一致。Ki67參與腫瘤增殖調控,與腫瘤分化程度、TNM 分期相關,可用于判斷腫瘤侵襲力,是預后不良的指標。Luo等[25]認為由于純黏液腺癌的組織學特征是細胞內黏液豐富的杯狀細胞和柱狀細胞的鱗狀生長,侵襲力低于非黏液生長模式中微乳頭等成分,因此單純型總體預后較好。

總之,本研究分析發現PPMA 有一定的臨床特征,并建立有效的預測模型,幫助早期識別、診斷PPMA,對臨床有一定的指導意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突