超聲輔助法提取黑豆中植酸工藝的研究

時寧寧 阮長青 李志江 張東杰

(黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319)(黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室2，大慶 163319)(國家雜糧工程技術研究中心3，大慶 163319)(黑龍江省雜糧加工及質量安全工程技術研究中心4，大慶 163319)

植酸是由環己六醇與6個磷酸基團結合而成，在植物中以植酸鹽形式存在，多數存在于種子中[1,2]。相關研究表明，植酸在一定程度上可以起到保護牙齒、預防腎結石以及防治糖尿病的效果，并且能夠通過誘導細胞凋亡而發揮抗腫瘤活性[3,4]，廣泛用于食品[5]、日化[6]、化工[7]等產業。在許多國家，谷物和豆類是微量元素重要的食物來源，豆類、玉米以及小麥和大米等植物籽粒大部分植酸分別存在于子葉、胚芽和糊粉層，普通的加工方式很難消除植酸帶來的影響[8-10]。此外，由于人體和單胃動物胃腸道內無法降解植酸，植酸進入腸道后會與營養物質形成復合物，并會影響相關酶的活性，從而降低了營養物質的生物利用度[11,12]。

豆粕、麩皮、米糠等農副產品等常被用于動物飼料，相關研究也多數在于通過動物體重、氨基酸和磷利用率等方式，來探究植酸的抗營養作用及其降解方法[13,14]。但是關于糧食作物中植酸的提取、植酸與營養物質間的相互作用及其機理等相關研究相對較少。黑豆作為一種深色雜豆，具有良好的食用和藥用價值，符合當前的消費觀念，有關黑豆的加工產品如黑豆醬油、黑豆乳、黑豆納豆等[15]。植酸的熱穩定性較好，在生產黑豆相關制品時如黑豆粉、炒黑豆、黑豆乳等，無法對植酸進行有效的控制。因此，通過對黑豆中植酸的提取進行研究，充分提取黑豆中的植酸，提升植酸質量，是了解黑豆植酸含量、組成、相關特性以及提高黑豆營養價值的基礎。

植酸的傳統提取方法耗時長、提取率偏低，采用超聲波輔助手段能顯著縮短提取時間并提升植酸提取率[16]。超聲波在傳播過程中通過對溶劑的壓縮和拉伸作用會形成空化泡，當空化泡破裂時產生極大的能量和負壓，從而強化傳質過程。同時，空化效應還伴隨著一系列其他效果，如局部剪切力、侵蝕、破碎以及增強水合作用等，這些因素導致了溶液中整體反應的增強和固體顆粒表面積增大，使目標物質更易溶出[17,18]。因此，實驗以黑豆為試材，以10%硫酸鈉-鹽酸作為浸提液，利用超聲波輔助法對黑豆中的植酸進行提取，研究不同實驗因素對植酸得率的影響，并通過響應面進行條件優化，以期最大程度提取黑豆中的植酸，可為植酸的純化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆(龍黑1號)，植酸(純度99%)，甘氨酸，濃鹽酸，三氯化鐵，磺基水楊酸，無水硫酸鈉。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-400KDE超聲波清洗器，HZQ-c氣浴恒溫振蕩器，TG16-WS高速離心機，723N可見分光光度計。

1.3 植酸的提取方法與條件優化

1.3.1 浸提法

根據文獻[19,20]進行適當修改，通過正交實驗設計得到酸浸法最佳提取工藝。稱取黑豆粉2.000 0 g于錐形瓶中，按照料液比1∶16加入pH為2的10%硫酸鈉-鹽酸溶液，于60 ℃下振蕩提取90 min，結束后于10 000 r/min離心10 min，將上清液移至50 mL容量瓶，定容備用。

1.3.2 超聲波提取及單因素實驗

超聲波取的固定條件為：pH 2，溫度60 ℃，料液比1∶14，超聲時間20 min，超聲功率200 W。在固定其他四個條件下分別考察pH(1、2、3、4、5)，溫度(30、40、50、60、70 ℃)，料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16)，超聲時間(5、10、15、20、25 min)，超聲功率(160、200、240、280、320 W)對植酸得率的影響。

1.3.3 響應面實驗設計

在單因素實驗結果的基礎上，選擇料液比、提取pH、超聲溫度、超聲功率為實驗因素，每個因素取3個水平，以植酸得率為指標進行Box-Behnken實驗設計(表1)。

表1 響應面實驗因素與水平表

1.4 植酸的測定方法

1.4.1 標準曲線的繪制

根據文獻[21,22]進行適當修改，方法如下：分別取1 mg/mL植酸標準溶液0.60、0.50、0.40、0.30、0.20、0.10 mL于10 mL容量瓶中，使用甘氨酸-鹽酸緩沖溶液(pH 2.4)定容，得到濃度為0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01 mg/mL的植酸標準溶液，分別移取5 mL于離心管中，并添加3 mL顯色劑(0.03%三氯化鐵-0.3%磺基水楊酸水溶液)，搖勻后靜置15 min，于8 000 r/min離心5 min，于498 nm處測上清液吸光度值，繪制出標準曲線。

1.4.2 植酸含量的測定

取0.2 mL提取液于15 mL離心管中，加入4.8 mL甘氨酸-鹽酸緩沖溶液(pH 2.4)，以及3 mL顯色劑，之后步驟同1.4.1，并通過植酸標準曲線計算出0.2 mL提取液中植酸含量。

(1)

式中：R為植酸的得率/mg/g；m為根據標準曲線計算得到的0.2 mL提取液中植酸的質量/mg；M為料質量/g。

1.5 數據處理及統計分析

所有實驗結果均是3次平行實驗得到的平均值，采用OriginPro 8.5繪制單因素實驗的直觀分析圖，使用Design-expert 8.0.6統計軟件對實驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

植酸標準曲線的方程為y=-2.672 8x+0.782 3，其中y為測定的吸光度值，x為所測溶液中的植酸含量，方程R2=0.999 6，說明所測溶液中植酸含量在0～0.3 mg范圍內線性關系較好。

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲時間對黑豆中植酸提取的影響

由圖1可知，在5～20 min范圍內，植酸得率緩慢上升，20 min時植酸達到最大值。超聲波能夠加速溶劑滲入到原料內部，并且會增大溶劑的流動速度，輔以細胞內外物質的濃度差，使得植酸的提取速度加快[23]。持續延長超聲時間，植酸從原料溶入溶劑中，植酸含量逐漸增大，當植酸的溶出達到平衡后，此時如果繼續延長浸提時間，細胞破碎程度增大，游離出的部分植酸會與環境中的其他物質形成復合物從而使植酸含量呈現出小幅度的下降趨勢[24,25]。因此選擇超聲20 min做為最佳提取時間。

2.2.2 溶液酸度對黑豆中植酸提取的影響

由圖1可知，在超聲波條件下浸提液的pH值對植酸得率的影響相對較大，隨著pH的升高，植酸得率先上升后下降，在pH 2時達到最大。在低pH值的環境下植酸與陽離子之間的結合力減弱，植酸變成游離狀態，但是如果pH過低，由于一些酸性多糖和蛋白的溶出量會增大，又會使游離植酸含量降低[26]。因此選擇pH 2為最佳提取酸度。

2.2.3 超聲溫度對黑豆中植酸提取的影響

由圖1可知，在30～60 ℃范圍內，隨著浸提溫度的升高，植酸含量也在不斷增大，在60 ℃時達到最大值，若繼續增加溫度，植酸得率開始下降。適當的升溫有助于加快傳質過程，使植酸更易溶出，但是溫度過高會導致蒸汽壓增大，更多的溶劑蒸汽進入氣泡腔內，使空化泡的破裂強度較小，從而減弱超聲效果[27]。另外，黑豆蛋白含量較高，而蛋白質在較高溫度下會發生變性，從而聚集沉淀，包裹部分植酸存在于殘渣中，從而使提取液中植酸的含量減少[28,29]。因此選擇60 ℃最為最佳提取溫度。

2.2.4 料液比對黑豆中植酸提取的影響

由圖1可知，在料液比1∶8～1∶16的范圍內，植酸得率隨著料液比的增大先迅速增加，之后在1∶14時達到最大。隨著料液比的增大，黑豆粉在溶劑中可以處于一種分散狀態，更多的溶劑更有利于植酸的溶出，并且植酸的擴散速率也會隨之增大，使植酸能夠充分進入到溶劑中。而超聲波所產生的各種效應可以使溶劑能更好地滲透到植物體內，從而提高溶劑滲透性，減少對所用溶劑的依賴。但是料液比過大，再加上超聲波的作用，原料中的其他物質也會溶出，從而在一定程度上降低溶劑中的植酸含量[30]。因此選擇1∶14作為提取的最佳料液比。

2.2.5 超聲功率對黑豆植酸提取的影響

由圖1可知，在超聲功率160～240 W的范圍內，植酸含量逐漸增大，在240 W時植酸得率達到最大值，此時繼續增大超聲功率，植酸得率則出現下降趨勢。超聲波的空化效應、機械效應、穿孔效應等共同作用使原料分子發生劇烈碰撞，細胞破裂，隨著功率的增大，該作用不斷增強，使得植酸得率隨著功率的增加而增大，但是功率過大也會導致部分植酸降解為低級磷酸肌醇，以及增加雜質的含量，使植酸得率下降[31,32]。因此選擇240 W為最佳超聲提取功率。

圖1 單因素實驗結果

2.3 響應面優化實驗

2.3.1 響應面結果與方差分析

根據Box-Behnken設計得到的方案與實驗結果如表2所示，使用Design-expert8.0.6統計軟件對實驗結果進行回歸擬合與顯著性檢驗，得到方差分析表(表3)。

表2 響應面實驗設計方案及結果

通過二次線性回歸擬合，得到的關于植酸得率的回歸方程為：Y=12.43-0.17A+0.052B+0.21C+0.005D+0.17AB-0.023AC+0.21AD-0.17BC-0.29BD-0.24CD-1.55A2-0.52B2-0.68C2-0.29D2

表3 響應面實驗方差分析

2.3.2 響應面分析

響應面圖的響應曲面表現了各因素對植酸得率的影響，曲面弧度越大表明此因素對植酸得率的影響越大，反之影響越小。等高線反映的是兩兩因素間交互作用的大小，等高線由圓形至橢圓形代表兩因素間的交互作用由小至大。通過分析交互作用顯著的響應面與等高線圖，可知對植酸得率影響最大的是pH值，其次是料液比和溫度，而超聲功率的影響最小，響應曲面相對平緩。兩兩因素間的交互作用強弱順序為：BD>CD>AD。

2.3.3 最佳工藝條件的確定

經響應面分析并結合回歸方程得出黑豆中植酸的最佳提取工藝為：pH 2、溫度60 ℃、料液比1∶14、超聲功率236 W、時間20 min，植酸得率預測值為12.35 mg/g。根據實際情況，將提取工藝調整為：pH 2、溫度60 ℃、料液比1∶14、超聲功率240 W、時間20 min，在此條件下進行3次重復實驗，植酸得率平均值為12.39 mg/g，與預測值誤差較小。因此，該模型可用于黑豆植酸的提取工藝，具有實際意義。

2.4 超聲波輔助提取與浸提法實驗結果比較

由表4可知，超聲波輔助法與浸提法相比，植酸得率提升了13.56%，并且減少了溶劑的使用，縮短了提取時間。

表4 超聲輔助法與浸提法結果對比

3 討論

超聲波輔助提取在我國最早應用于中草藥有效成分的提取，其主要特點是縮短提取時間、提高得率并且不破壞有效成分，目前已廣泛應用于醫藥、食品、化工等行業。超聲波所產生的空化效應、機械效應、毛細管效應等各種效應在整個提取過程中協同、反復作用使得整個提取過程速度加快，細胞破碎程度增大，因此具有縮短時間、減少溶劑用量、提高得率的特點[33-35]。有研究發現，植酸除了與金屬陽離子結合形成植酸鹽外，還會與蛋白質結合，儲存在蛋白質儲存液泡的膜結合腔室，其中含有植酸晶體和以溶解液泡為特征的蛋白質，而超聲波可能會破壞腔室釋放植酸，從而提升植酸得率[36]。

由實驗結果可知，pH值和料液比對黑豆中植酸提取的影響較大，主要是因為植酸的螯合能力較強，較低pH下會與蛋白質形成二元復合物，而較高pH下會與金屬和蛋白質形成三元復合物，因此在提取時應對溶液pH和料液比進行嚴格控制。通過與傳統浸提法相比，超聲波輔助提取用時少、溶劑用量少并且植酸得率升高，主要原因是超聲波的空化效應及其產生的其他效應增大了傳質速度，并在短時間內破壞原料結構，使溶劑更快的深入到細胞內，加快了植酸的溶出。

使用水浴形式進行超聲波輔助提取時應注意的是，超聲波的強度會因水浴、容器的形狀和厚度等因素受到一定的影響，因此應選擇平底、厚度較薄的容器，以減少超聲波的衰減[34]。由于超聲波在提取過程出會釋放熱量，功率越大對溫度的影響越大，使得實際溫度會超過設定溫度。另外，超聲波的頻率越低其空化效應越強，理論上提取效果也越好，因此應該對較低或較高超聲波功率以及超聲頻率對植酸提取的影響進行研究[18]。

4 結論

本研究建立了超聲波輔助法提取黑豆中植酸的工藝條件，相對于傳統提取方式減少了溶劑的使用量，并且很大程度上縮短了提取時間。實驗以黑豆為原料，選擇10%硫酸鈉-鹽酸作為浸提液，考察了pH、溫度、料液比、時間、超聲功率對黑豆中植酸提取的影響，并在此基礎上進行響應面設計，獲得最佳提取工藝為：pH 2、溫度60 ℃、料液比1∶14、超聲功率240 W、時間20 min, 在此條件下植酸得率為12.39 mg/g，相對于浸提法，超聲波輔助法提取植酸得率提升了13.56%。