番瀉苷A對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化和免疫紊亂的保護(hù)作用

王常清，張萬濤，唐鳳，楊江帆，覃鴻恩，周輝

（恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院1.中藥房；2.西藥房；3.制劑室，湖北恩施 445000；4.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院西藥房，湖北恩施 445000）

肺纖維化是急性、慢性肺部疾病的最終結(jié)果，通常與遺傳性免疫功能障礙、化學(xué)毒性、感染、環(huán)境污染等因素有關(guān)[1]。肺纖維化主要的臨床表現(xiàn)為限制性通氣功能障礙、進(jìn)行性呼吸困難、刺激性干咳、彌散功能降低等，雙肺彌漫性病變是其典型的影像學(xué)特征，患者確診后病情進(jìn)展快，死亡率較高，但目前仍缺乏確切有效的治療手段[2?3]。盡管肺纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但目前普遍認(rèn)為是炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡等多種機(jī)制相互作用的結(jié)果[4?5]。番瀉葉是一種藥用價值較高的中藥藥材，主要用于改善便秘、解決大便干燥，主要活性成分包括番瀉苷A（sennoside A，SA）、番瀉苷B、大黃酚、大黃素、大黃酸等[6]。研究表明，大黃素[7]、大黃酸[8]可通過不同作用途徑保護(hù)肺部炎性損傷。但來自相同母體SA在肺部疾病的相關(guān)研究較少，本課題前期預(yù)實驗初步發(fā)現(xiàn)，SA對肺纖維化大鼠具有保護(hù)作用。因此，本研究主要將探討SA對博來霉素（bleomycin，BLM）誘導(dǎo)肺纖維化大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制，旨在為肺纖維化的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只SD大鼠，SPF級，雄性，6~8周齡，體質(zhì)量200~240 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019?0115。

1.2 藥品、試劑與主要儀器

SA（成都瑞芬思生物科技有限公司）；BLM（浙江海正藥業(yè)股份有限公司）；MASSON試劑（南京建成科技有限公司，批號：20180025）；纖維連接蛋白（FN）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF?β）、α?平滑肌蛋白（α?SMA）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）及白細(xì)胞介素10（IL?10）蛋白一抗（美國CST，批號：9532、1165、2358、4175、8630）；白細(xì)胞介素（IL?1β、IL?4、IL?10）及iNOSELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：20180120、20181054、20190108、20190337）；AniRes2005型小動物肺功能儀（北京貝蘭博科技有限公司）；iMARK系列酶標(biāo)儀、CFX96熒光定量PCR儀（美國BioRad）。

1.3 大鼠肺纖維化模型的建立與給藥

將50只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、模型+SA低、中、高劑量處理組，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，除正常組外，其他組大鼠一次性氣管滴注5 mg/kg BLM構(gòu)建肺纖維化模型，再輕輕搖擺大鼠30 s，使藥液在肺內(nèi)均勻分布，正常組大鼠滴注等體積生理鹽水。建模后第1天，模型+SA低、中、高劑量處理組分別灌胃25、50、100 mg/kg SA[9]，1次/d，連續(xù)灌胃28 d，正常組和模型組以等體積生理鹽水。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 肺功能檢測 給藥結(jié)束后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，于氣管正中切口，插入氣管插管，連接小動物肺功能儀，檢測靜息通氣量、氣道阻力及肺容積。

1.4.2 樣本采集 麻醉大鼠收集腹主動脈血，3000r/min離心20 min，分離上層血清，凍存于?80℃冰箱。迅速取出肺組織，分別稱量肺組織濕質(zhì)量和干質(zhì)量，計算干濕重比值，部分固定于4%（φ）多聚甲醛中，剩余肺組織凍存于液氮罐。

1.4.3 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 肺組織固定24 h后，制成4μm厚的石蠟切片，分別進(jìn)行HE、MASSON染色，光鏡下觀察肺組織病理變化和纖維化程度，參照Szapiel等[10]方法，對HE染色結(jié)果進(jìn)行肺損傷評分。

1.4.4 ELISA檢測 取血清樣本，按ELISA試劑盒說明，檢測血清中IL?1β、IL?4、IL?10及iNOS的含量。

1.4.5 RT?PCR檢測 取適量凍存肺組織，添加Trizol試劑提取肺組織中總RNA，經(jīng)微量核酸儀檢測提取物純度、濃度，再通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整度；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，按試劑盒說明進(jìn)行RT?PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。FN上游引物序列：5’?TGACAACTGCCCGTAGACCT?GG?3’，下游引物序列：5’?TACTGGTTGTAGGTGT?GGCCG?3’；TGF?β上游引物序列：5’?GTCAAA GGGCATCTAAAGC?3’，下游引物序列：5’?CAA AGAACTCCTGGATAAACT?3’；α?SMA上游引物序列：5’?TCCTGACCCTGAAGTATCCG?3’，下游引物序列：5’?TCTCCAGAGTCCAGCA?CAAT?3’；GADPH上游引物序列：5’?GGCACAGT?CAA GGCTGAGAATG?3’，下游引物序列：5’?ATG?GTGGTGAAGACGCCAGTA?3’。以GADPH為內(nèi)參，計算FN、TGF?β及α?SMA mRNA的相對表達(dá)量。

1.4.6 Western blot檢測 取適量凍存肺組織，添加裂解緩沖液提取肺組織中蛋白，混合5×上樣緩沖液中，經(jīng)沸水浴變性10 min，配制10%（φ）聚丙烯酰胺?SDS凝膠，取等量變性蛋白進(jìn)行電泳，再通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于含有5%脫脂奶粉的封閉液中孵育2 h，稀釋比1∶1 000的蛋白一抗中，4℃下孵育過夜，稀釋比1∶8 000的蛋白二抗中，室溫孵育1 h，最后化學(xué)發(fā)光顯影。應(yīng)用Image J軟件檢測各條帶灰度值，目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值的比值表示該目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SA對肺纖維化大鼠肺損傷評分和肺組織干濕質(zhì)量比的影響

如圖1，與正常組比較，模型組肺損傷評分和肺組織干濕質(zhì)量比明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，SA中、高劑量處理組肺損傷評分和肺組織干濕質(zhì)量比明顯降低（P<0.05）；但SA低劑量處理組與模型組上述指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 SA對肺纖維化大鼠肺損傷評分和肺組織干濕比的影響Figure 1 Effect of SA on lung injury score and lung dry/wet ratio in rats with pulmonary fibrosis

2.2 SA對肺纖維化大鼠肺功能指標(biāo)的影響

如圖2，與正常組比較，模型組大鼠靜息通氣量、氣道阻力及肺容積明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，SA中、高劑量處理組靜息通氣量、氣道阻力及肺容積明顯升高（P<0.05）；但SA低劑量處理組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖2 SA對肺纖維化大鼠肺功能指標(biāo)的影響Figure 2 Effect of SA on pulmonary function indexes in rats with pulmonary fibrosis

2.3 SA對肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響

如圖3，正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡間隔明顯增厚，炎性細(xì)胞浸潤顯著；SA低、中、高劑量處理組肺組織中仍有肺泡損害、間隔增厚和炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，其中中、高劑量組肺組織損傷程度較模型組輕。

圖3 SA對肺纖維化大鼠肺組織病理損傷的影響(HE，200×)Figure 3 Effect of SA on pathological injury of lung tissue in rats with pulmonary fibrosis(HE,200×)

2.4 SA對肺纖維化大鼠肺組織纖維化程度的影響

如圖4，正常組肺泡結(jié)構(gòu)正常，藍(lán)色染色區(qū)域極少；模型組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡融合，藍(lán)色染色區(qū)域面積較正常組明顯增加；SA低、中、高劑量處理組肺泡結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出不同程度的損傷，其中中、高劑量組藍(lán)色染色區(qū)域面積較模型組明顯減少。

圖4 SA對肺纖維化大鼠肺組織纖維化程度的影響（MASSON，200×）Figure 4 Effect of SA on the degree of pulmonary fibrosis in rats with pulmonary fibrosis(MASSON,200×)

2.5 SA對肺纖維化大鼠免疫相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)的影響

如圖5，與正常組比較，模型組大鼠血清IL?1β、iNOS、IL?4、IL?10含量、肺組織中iNOS及IL?10表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，SA中、高劑量處理組血清IL?1β、iNOS含量、肺組織中iNOS表達(dá)明顯降低，血清IL?4、IL?10含量、肺組織中IL?10表達(dá)明顯升高（P<0.05）；但SA低劑量處理組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖5 SA對肺纖維化大鼠免疫相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)的影響Figure 5 Effect of SA on the expression of immune related markers in rats with pulmonary fibrosis

2.6 SA對肺纖維化大鼠肺組織中纖維化標(biāo)記物表達(dá)的影響

如圖6，與正常組比較，模型組大鼠肺組織中FN、TGF-β、α?SMA mRNA及蛋白的表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，SA中、高劑量處理組FN、TGF-β、α?SMA mRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低（P<0.05）；但SA低劑量處理組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖6 SA對肺纖維化大鼠肺組織中纖維化標(biāo)記物表達(dá)的影響Figure 6 Effect of SA on the expression of fibrosis markers in lung tissue of rats with pulmonary fibrosis

3 討論

肺纖維化主要包括3個階段，肺內(nèi)炎癥階段（免疫反應(yīng)階段）、肺實質(zhì)損傷階段及肺泡腔纖維化/肺泡塌陷階段，其中肺泡上皮細(xì)胞受損、肺泡炎癥、膠原沉積等是其主要發(fā)病因素[11]。肺纖維化早期病理表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎癥，多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞因子刺激成纖維細(xì)胞過度增殖，轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂，一部分細(xì)胞外基質(zhì)成分過度沉積于肺間質(zhì)和肺泡，加之纖維組織異常修復(fù)，破壞肺組織固有的正常結(jié)構(gòu)，最終致使肺纖維化的發(fā)生[12]。肺組織干濕比是反映肺實變的直觀指標(biāo)之一，細(xì)胞水腫、炎性物質(zhì)伸出及毛細(xì)血管充血等因素是干濕比升高的直接原因[13]。本研究結(jié)果顯示，SA可有效減輕肺纖維化大鼠肺損傷評分和肺組織干濕質(zhì)量比，提示SA對肺纖維化大鼠肺組織具有保護(hù)作用。

BLM是一類多肽類抗腫瘤藥物，其誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型，主要病理特征為肺組織內(nèi)慢性炎癥和纖維化，這與人肺纖維化表現(xiàn)近似[14]。肺組織病理形態(tài)觀察顯示，模型組大鼠肺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡間隔明顯增厚，炎性細(xì)胞浸潤顯著，間質(zhì)內(nèi)有大量膠原纖維增生，但中、高劑量SA處理后肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯減輕，肺組織膠原沉積也明顯減少，提示SA可減輕BLM誘導(dǎo)的肺纖維化。靜息通氣量、氣道阻力及肺容積等肺功能指標(biāo)常用于判斷氣流受限，這對于肺纖維化的診斷、病情進(jìn)展、治療及預(yù)后均有指導(dǎo)性意義[15]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，SA中、高劑量處理組靜息通氣量、氣道阻力及肺容積明顯升高，提示SA對肺纖維化大鼠肺功能有明顯的改善作用。

肺組織損傷后產(chǎn)生的肺泡內(nèi)炎癥，會使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致肺內(nèi)發(fā)生具有不可逆性的纖維化[16]。FN是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，α?SMA是活化的成纖維細(xì)胞的典型標(biāo)志物，α?SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞是主要的基質(zhì)合成細(xì)胞，而TGF?β則是重要的致纖維化因子，可活化成纖維細(xì)胞，刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成，并誘導(dǎo)多種促纖維化細(xì)胞因子的分泌[17]。本研究中，BLM誘導(dǎo)后大鼠肺組織中FN、α?SMA、TGF?β的表達(dá)上調(diào)，SA處理后FN、α?SMA、TGF?β的表達(dá)下調(diào)，提示SA可能通過抑制FN、α?SMA、TGF?β的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，發(fā)揮抗纖維化作用。另外，ELISA和Western blot檢測結(jié)果顯示，肺纖維化大鼠促炎細(xì)胞介質(zhì)IL?1β、iNOS和抑炎細(xì)胞介質(zhì)IL?4、IL?10均升高，表明肺纖維化大鼠體內(nèi)炎癥免疫反應(yīng)處于較高水平，SA處理后IL?1β、iNOS水平降低，IL?4、IL?10水平大幅升高，提示SA可有效減輕肺纖維化大鼠的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫紊亂。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SA可減輕BLM誘導(dǎo)的肺纖維化，改善肺纖維化大鼠肺功能，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫紊亂、抑制細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積有關(guān)。