NOX4抑制劑GKT137831誘導肺鱗癌H226細胞凋亡及增強紫杉醇敏感性的研究

宋少飛，劉冰

（廣東藥科大學藥學院，廣東廣州 510006）

癌癥是目前影響人類生命健康的重要疾病。近年來死于癌癥的人數逐年增加，其中肺癌作為最常見的癌癥之一，其發病率和致死率在眾多癌癥中位居榜首。肺癌主要有兩種類型，小細胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）和非小細胞肺癌（non?small cell lung carcinoma，NSCLC），其 中NSCLC約占肺癌總數的80%~85%，而NSCLC又包括肺鱗癌、肺腺癌、大細胞癌。與肺腺癌不同的是，肺鱗癌的發病與吸煙密切相關，多為中央型，容易累及大血管，出現中心空泡和大出血，危及生命。且現有化療效果較差，治療方案有限，預后不良[1]。因此迫切需要探索新的、更加有效的抗肺鱗癌藥物以及治療方案。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotnamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)是一種廣泛分布于機體內各個組織的跨膜蛋白，包括NOX1，NOX2，NOX3，NOX4，NOX5，以及Duox1和Duox2等7個亞型[2]。其中NOX4與癌癥的發生發展密切相關，抑制NOX4活性能夠抑制腫瘤的生長并促進癌細胞的死亡[3]。此外，有研究發現，在肺腺癌及肺鱗癌中，NOX4在癌組織中的表達量顯著高于癌周組織[4]。除此之外，目前已證實在A549細胞中，NOX4過表達能提高白細胞介素?6（interleukin?6，IL?6）的自分泌水平。IL?6是促進NSCLC惡性進展最重要的炎癥因子之一，可由多種炎性細胞產生并分泌，腫瘤細胞自身也可產生大量IL?6[5?6]。體內外實驗表明，IL?6促進NSCLC細胞增殖的原因，可能與腫瘤細胞中激活Jak2/Stat3信號通路有關[7?9]。上述提示NOX4可能是抗NSCLC的一個潛在有效靶點。

GKT137831是NADPH氧化酶NOX4和NOX1亞型的雙重抑制劑。其在體外和體內動物藥理模型中顯示出生物學活性，包括治療肝纖維化、動脈粥樣硬化等[10?11]。在肺腺癌A549細胞中，GKT137831能夠增強順鉑對細胞的毒性效應[12]。因此，GKT137831對于肺鱗癌的治療值得進一步探討。

本研究以肺鱗癌H226細胞為實驗對象，檢測GKT137831和紫杉醇單用以及二者聯用對細胞生存的影響，檢測GKT137831對肺鱗癌H226細胞凋亡的影響，檢測GKT137831對肺鱗癌H226細胞中IL?6 mRNA表達的影響，并初步探討GKT137831是否通過IL?6/Jak2/Stat3信號通路誘導肺鱗癌H226細胞凋亡，有望為GKT137831的臨床抗肺鱗癌應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥物與試劑

GKT137831、紫杉醇均購于美國Selleck公司。細胞培養試劑購于美國Gibco公司。Annexin V?FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于貝博生物科技公司。BCA蛋白定量試劑盒購于Thermo Scientific公司。SDS?PAGE蛋白上樣緩沖液購于Mikx公司。p?Jak2、Jak2、p?Stat3、Stat3、Bcl?2、Bax及β?Tubulin抗體購于美國Abcam公司。山羊抗兔IgG購于Cell Signaling Technology公司。RNA快速提取試劑盒（RN001）購于上海奕杉生物科技公司。Rever Tra Ace recerse transcriotase和SYBR Green Realtime PCR Master Mix均購于TOYOBO。

1.2 主要儀器

HF151UV型CO2培養箱購于上海力申科學儀器有限公司。A35062CN流式細胞儀、1510酶標儀購于Thermo Scientific公司。Microfugu20R冷凍離心機購于Beckman coulter公司。3300029?7Q化學發光成像系統購于上海勤翔科學儀器有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養

將肺鱗癌H226細胞于液氮罐中取出，37℃水浴融化，用1 mL移液槍快速將細胞吸到提前準備好的15 mL的離心管中，然后于低溫離心機中1 000 r/min離心2 min，去除培養基。同時于離心管中加入4 mL新鮮培養基，用移液槍吹打培養基，使H226細胞均勻分布，轉入25 mL培養瓶中,放置于37℃5%（φ）CO2培養箱中。24 h后，在同一時間點更換新鮮培養液。待細胞鋪滿培養皿80%~90%以上時，進行傳代。

2.2 MTT法檢測細胞存活率

采用MTT法檢測GKT137831對肺鱗癌細胞生存的影響。將H226細胞消化并計數，以每孔4 000個細胞接種于96孔板中。待細胞貼壁后，用GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）分別處理肺鱗癌H226細胞24 h、48 h和72 h、用紫杉醇（0、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L）處理H226細胞48 h，并選取合適濃度的紫杉醇與GKT137831聯用處理48 h。藥物干預結束后，加入濃度為0.5 mg/mL的MTT，每孔加20μL并在37℃下避光孵育4 h。最后，吸去96孔板中液體，每孔加入二甲基亞砜150μL，并用酶標儀在570 nm處測量每個孔的吸光度（A）值。細胞存活率=（實驗組A值?對照組A值）/對照組A值×100%。

2.3 Annexin V?FITC/PI法檢測細胞凋亡

用細胞凋亡Annexin V?FITC和碘化丙啶（PI）雙染測定試劑盒染色，并通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。將H226細胞接種于60 mm培養皿中，待細胞貼壁后給予不同濃度GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）處理24 h。藥物干預結束后，用不含EDTA胰酶消化并收集細胞。PBS重懸2次后，加入Annexin V結合緩沖液并在避光條件下用5.0μmol/L Annexin V?FITC孵育15 min，然后加入10.0μmol/L碘化丙啶（PI）避光孵育5 min。用流式細胞儀進行分析。

2.4 Real?time qPCR法檢測IL?6 mRNA的表達

采用Real?time qPCR法檢測IL?6 mRNA的表達。將肺鱗癌H226細胞消化并接種于小皿中，待細胞貼壁后用不同濃度GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）處理12 h。藥物干預結束后，使用試劑盒從細胞中提取總RNA，然后根據說明書要求，使用Rever Tra Ace逆轉錄酶合成互補DNA（cDNA）。按照SYBRGreen實時PCR預混液在iCycler（Bio?Rad）上進行RT?PCR。引物序列如下：IL?6上游引物：5’?GGTGTTGCCTGCCTTCC?3’；IL?6下 游 引 物：GTTCTGAAGAGGTGAGTGGCTGTC?3’；GAPDH上 游 引 物：5’?GGCACCGTCAAGGCTGAGAAC?3’；GAPDH下游引物：5’?CATGGTGGTGAAGAC?GCCAGTG?3’。

使用2?ΔΔCt方法計算每次擴增的基因表達水平，并對GAPDH的mRNA進行標準化。

2.5 Western blot法檢測蛋白表達

用Western blot法檢測肺鱗癌H226細胞中p?Jak2、Jak2、p?Stat3、Stat3、Bcl?2、Bax蛋白的表達水平。將肺鱗癌H226細胞接種于小皿中，待細胞貼壁后用不同濃度GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）處理12 h。藥物干預結束后加入細胞裂解緩沖液與0.5%蛋白酶抑制劑混合物獲得全細胞提取物。經過電泳、電轉及封閉的過程后，分別在4℃下孵育抗體過夜，二抗孵育1 h，顯色。

2.6 統計學方法

實驗所得數據計量資料以均數±標準差（±s）表示，應用GraphPad Prism 7.01軟件，采用Student’s test檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 GKT137831對肺鱗癌H226細胞存活率的影響

MTT實驗結果顯示，GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）給藥干預肺鱗癌H226細胞24 h、48 h和72 h后可呈時間和劑量依賴性抑制肺鱗癌H226細胞的存活，見圖1。

圖1 GKT137831對肺鱗癌H226細胞存活率的影響Figure 1 Effect of GKT137831 on the survival of lung squa?mous cell carcinoma H226 cells

3.2 GKT137831對肺鱗癌H226細胞凋亡的影響

采用Annexin V?FITC/PI法檢測細胞凋亡，結果顯示，GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）給藥干預24 h后呈劑量依賴性誘導H226細胞凋亡（見圖2A）。Western blot實驗結果顯示，GKT137831呈劑量依賴性減少抗凋亡蛋白Bcl?2的表達量及增加促凋亡蛋白Bax的表達量（見圖2B和圖2C）。

圖2 GKT137831對肺鱗癌H226細胞凋亡及相關凋亡蛋白的影響Figure 2 Effect of GKT137831 on apoptosis and apoptosis related proteins of lung squamous cell carcinoma H226 cells(n=3)

3.3 GKT137831對肺鱗癌H226細胞中IL?6 mRNA表達的影響

Real?time qPCR實驗結果顯示，GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）給藥干預12 h后呈劑量依賴性降低肺鱗癌H226細胞中IL?6 mRNA的表達水平（P<0.05），見圖3。

圖3 GKT137831對肺鱗癌H226細胞中IL?6 mRNA表達的影響Figure 3 Effect of GKT137831 on the expression of IL?6 mRNA in lung squamous cell carcinoma H226 cells

3.4 GKT137831對肺鱗癌H226細胞Jak2/Stat3通路的影響

Western blot實驗結 果顯示，GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）給藥干預12 h后呈劑量依賴性減少肺鱗癌H226細胞中磷酸化Jak2、磷酸化Stat3，見圖4A~圖4C。

圖4 不同濃度GKT137831對肺鱗癌H226細胞中Jak2/Stat3通路蛋白表達的影響Figure 4 Effect of GKT137831 on the expression of JAK2/STAT3 pathway protein in lung squamous cell carcinoma H226 cells(n=3)

3.5 GKT137831對紫杉醇的增敏作用

MTT實驗結果顯示，用不同濃度紫杉醇（0、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L）給藥干預48 h后，紫杉醇可呈劑量依賴性抑制肺鱗癌H226細胞的存活率（見圖5A)。此外，本研究選取10.0μmol/L GKT137831和20.0 μmol/L紫杉醇作為聯合用藥的濃度，結果表明，與單獨用藥組相比，聯合用藥組更顯著抑制肺鱗癌H226細胞的存活（P<0.05），見圖5B。

圖5 GKT137831對紫杉醇的增敏作用Figure 5 Sensitization of GKT137831 to paclitaxel

4 討論

既往研究表明，NOX與癌癥的發生發展密切相關，抑制NOX的活性能夠抑制腫瘤生長并促進癌細胞的死亡[3]。此外，研究證實NOX4在NSCLC中高表達，且在不同層次上證實其可通過激活ROS/PI3K/Akt信號通路促進NSCLC增殖[13]。而在NSCLC中，肺鱗癌目前現有化療效果較差，治療方案有限，預后不良。故急需要探索新的更加有效的抗肺鱗癌藥物以及治療方案。本研究發現GKT137831可呈時間和劑量依賴性抑制肺鱗癌H226細胞的存活，并且可呈劑量依賴性誘導肺鱗癌H226細胞凋亡，同時減少抗凋亡蛋白Bcl?2的表達量及增加促凋亡蛋白Bax的表達量。

目前已證實在肺腺癌A549細胞中，NOX4過表達能提高IL?6自分泌水平[6]。但目前尚未有研究報道肺鱗癌細胞中NOX4抑制劑GKT137831是否能夠影響IL?6的表達。本研究發現，GKT137831可呈劑量依賴性降低IL?6 mRNA的表達水平。體內外實驗表明IL?6可促進NSCLC細胞增殖，這一效應主要通過激活Jak2/Stat3信號通路而產生[7,9]。Jak2/Stat3信號通路是近年來發現的一條與細胞增殖、腫瘤發生發展密切相關的信號通路。通過阻斷Jak/Stat3信號通路的傳導能夠誘導癌細胞凋亡[14]。本研究結果顯示，GKT137831可呈劑量依賴性減少磷酸化Jak2、磷酸化Stat3。因此GKT137831可能通過降低IL?6的表達從而抑制Jak2/Stat3信號通路來誘導肺鱗癌細胞凋亡。

紫杉醇是晚期肺癌治療的常用化療藥物，但眾多患者對紫杉醇的敏感性不高[15],聯合用藥是目前解決病人對紫杉醇敏感性下降的主要手段之一[16]。本研究結果表明，與單獨用藥組相比，GKT137831與紫杉醇聯合使用，對肺鱗癌H226細胞存活的抑制顯著增強，故GKT137831能增強紫杉醇的敏感性。但GKT137831增強紫杉醇敏感性的機制仍需進一步深入研究。

綜上所述，NOX4抑制劑GKT137831能誘導肺鱗癌細胞凋亡并增強紫杉醇的敏感性，且其誘導肺鱗癌H226細胞凋亡可能與抑制IL?6/Jak2/Stat3信號通路有關。本研究結果提示，GKT137831可能在肺鱗癌的治療中發揮重要作用，為臨床抗肺鱗癌提供了依據。