異甜菊醇衍生物的合成及其抗氧化應激研究

柯晴瑾，羅利萍，張曉鋒，譚文

（1.廣東工業大學生物醫藥學院，廣東廣州 510006；2.乳源瑤族自治縣應急管理局，廣東韶關 512700）

異甜菊醇（isosteviol）是從甜菊糖酸酸水解中獲得的一種貝葉烷型四環二萜，具有很多生物活性[1]。研究顯示，異甜菊醇在缺血再灌注心臟病中具有心臟保護作用，并能減少心律不齊[2?4]。異甜菊醇結構中的C15、C16羰基和C19羧基是3個良好的結構修飾位點，經結構修飾和改造得到的異甜菊醇衍生物表現出良好的生物活性：WU等[5?6]合成了一系列含羥基、羥甲基和含氮雜環的異甜菊醇衍生物，研究結果顯示吲哚衍生物具有抑制α?葡糖苷酶活性；HUANG等[7]合成了一系列具有C4?酰胺取代基的異甜菊醇衍生物，發現所測化合物具有有效的HBV活性；ZHU等[8]合成了雜環橋聯的碳硫酰胺類異甜菊醇衍生物，并證明了引入碳硫酰胺基取代的吡唑和異惡唑烷雜環片段可增強異甜菊醇的細胞毒活性；WANG等[9]制備了一系列含有二萜骨架和一氧化氮（NO）供體的異甜菊醇衍生物，篩選出了對HepG2及B16F10細胞具有抗增殖活性的衍生物；SHI等[10]在異甜菊醇結構上引入三唑雜環合成了一系列衍生物，在體外抗凝研究中2個衍生物顯示出抗凝活性。

本課題組前期研究了異甜菊醇在不同的心肌細胞損傷模型的保護作用發現，異甜菊醇可通過調節線粒體分裂蛋白恢復線粒體功能，降低細胞活性氧生成，抑制細胞凋亡，起到抗氧化應激作用[11?14]；另外，通過串聯Cannizzaro歧化/Aldol羥醛縮合反應在C?15和C?16進行結構修飾后得到異甜菊醇衍生物，發現這些衍生物對DOX誘導的斑馬魚胚胎的心臟毒性具有保護作用[15]。在前期研究的基礎上，本研究在C?19活潑位點引入苯并咪唑和3?氨基?2?羥基吡啶片段合成新的異甜菊醇衍生物，同時考察前期合成的衍生物[15]和新的衍生物的抗氧化應激損失作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ML303T/02、ML104T/02電子天平[梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司]；85?1磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；HWCL?1型集熱式恒溫磁力攪拌浴（鄭州長城科工貿有限公司）；ZF?20D型暗箱三用紫外分析儀[驥輝分析儀器（上海）有限公司]；N?1210型EYELA旋轉蒸發儀、真空干燥箱VOS?60A[施都凱儀器設備（上海）有限公司]；S10H型超聲波清洗機[致微（廈門）儀器有限公司]；Alliacen e2695超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Q ExactiveOrbitrap高分辨質譜儀（美國Ther?mo scientific公司）；核磁共振儀（德國布魯克公司）；Esco二氧化碳培養箱（藝思高科技有限公司）；5424R離心機（德國Eppendrof公司）；Axio Observer Z倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）；TriStar2SLB942S多功能酶標儀（德國Berthold公司）；FAC?SCelesta分析型流式細胞儀（美國BD公司）。

3?氨基?2?吡啶酮、苯并咪唑、N,N?二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醛溶液（37%）、四甲基哌啶氮氧化物（TEMPO）、KI、SOCl2均購于艾覽（上海）化工科技有限公司；次氯酸鈉、亞氯酸鈉、三乙胺（TEA）、NaOH、乙醇均購于阿拉丁試劑(上海)有限公司；H2O2購于科龍化工有限公司；以上試劑均為分析純。

H9c2心肌細胞系購買于中國科學院上海生科院細胞資源中心；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibico公司）；活性氧（ROS）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；二甲基亞砜DMSO、CCK?8檢測試劑盒（Biosharp）；青霉素?鏈霉素溶液、LDH檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

1.2 異甜菊醇衍生物的合成

合成路線如圖1所示。其中異甜菊醇衍生物A和B為前期研究合成所得[15]，化合物D和E為新合成，4種衍生物均為白色固體粉末。

圖1 異甜菊醇衍生物合成路線Figure 1 The synthetic route of isosteviol derivatives

稱取300 mg異甜菊醇溶于1.2 mL SOCl2溶液中，76℃反應4 h，得到粗產物C。

100 mg粗產物C溶于10 mL無水DCM，加入120 mg 3?氨基吡啶?2（1H）?酮和0.2 6mL TEA，143 mg HATU，室溫反應2~4 h。反應結束后，用水萃取產物，加入無水Na2SO4干燥，通過柱色譜法純化（洗脫液：PE∶EA=1∶1）得到衍生物D（80 mg，80%產率）。

450 mg粗產物C溶于5 mL無水DCM，加入173.46 mg苯并咪唑和2 mL TEA，室溫反應2~4 h。反應結束后，用水萃取產物，加入無水Na2SO4干燥，通過柱色譜法純化（洗脫液：PE∶EA=4∶1）得到衍生物E（219 mg，75%產率）。

化合物D和E，用高效液相色譜（HPLC）法對衍生物進行了純度測定，D純度為97.8%，E純度為96.74%。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞培養和處理 H9c2心肌細胞用含2 mmol/LL?谷氨酰胺、10%（體積分數）胎牛血清、青霉素（10 000 U/mL）和鏈霉素（10 000μg/mL）的DMEM培養基培養于37℃、5%CO2細胞培養箱中。實驗前將細胞接種在細胞培養皿或孔板上24 h后，選擇貼壁90%以上生長良好的心肌細胞，用500μmol/L的H2O2處理2 h，或在H2O2處理之前用不同衍生物預處理24 h。

1.3.2 細胞活力及乳酸脫氫酶LDH測定 為了探討H2O2濃度對心肌細胞活力和膜穩定性的影響，用100~500μmol/L H2O2處理H9c2心肌細胞2 h后，利用CCK?8檢測試劑盒檢測細胞的活性。除去培養基，將新鮮制備的10%CCK?8溶液添加到每個孔中，并在37℃下孵育2 h后，立即使用酶標儀在450 nm處測量每個孔的吸光度。采用乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒檢測細胞釋放到培養上清液中的乳酸脫氫酶活性，處理好的細胞，每孔吸取120μL培養上清液到新的96孔板中，加入60μL LDH檢測工作液，室溫輕搖30 min，使用酶標儀在490 nm處測量每個孔的吸光度。

1.3.3 細胞凋亡和壞死的檢測 采用AnnexinV?FITC/PI雙染法對細胞的凋亡和壞死的水平進行檢測。經H2O2或衍生物處理后的細胞，經無芬紅胰酶消化、PBS洗滌后，加入400μL 1X的AnnexinV?FITC結合液懸浮細胞，加入5μLAnnexinV?FITC染色液，混勻后4℃避光孵育15 min；加入10μL PI染色液，混勻后4℃避光孵育15 min，立即用流式細胞儀進行檢測，熒光通道設置為FITC和PI。

1.3.4 細胞內活性氧（ROS）的檢測 采用二氯熒光素（DCFH?DA）對細胞內ROS進行測定。將H9c2心肌細胞鋪在六孔板上，并在有或沒有加入衍生物的情況下預處理24 h，然后用500μmol/L H2O2處理2 h。細胞經PBS洗滌后，與2μmol/L DCFH?DA在37℃孵育30 min。用0.25%的胰蛋白酶（不含EDTA和酚紅）洗滌過量的DCFH?DA后，加入300μLPBS中，并使用流式細胞儀檢測熒光強度。使用flowjo軟件（版本7.6.1）分析數據，并用FITC陽性細胞的百分比表示細胞內ROS水平。

2 結果

2.1 衍生物結構表征

化合物A和B表征結果參考課題組前期研究結果[15]。

衍生物D：1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：8.72（d，J=4.2 Hz，1H），8.42（d，J=8.3 Hz，1H），7.43（dt，J=39.2，19.5 Hz，1H），2.77（dd，J=18.5，2.9Hz，1H），2.48（d，J=13.8 Hz，1H），2.10~1.95（m，3H），1.90~1.83（m，2H），1.75（d，J=12.8 Hz，2H），1.67（d，J=15.1 Hz，2H），1.64（s，3H），1.63~1.55（m，3H），1.50~1.38（m，3H），1.37~1.33（m，1H），1.33~1.26（m，3H），1.07（s，3H），1.04（d，J=3.2 Hz，1H），1.02（s，3H）。13CNMR（150 MHz，CDCl3）δ：222.22，173.23，151.71，140.81，134.96，129.25，120.75，57.31，54.75，54.20，48.71，48.41，44.29，41.26，39.46，38.62，38.29，38.00，37.24，28.80，21.68，20.38，19.86，18.86，14.09。HRAMLC?MS/MS：m/z：409.2486（6）[M?H]?（calcdforC25H34N2O3，410.2569）。

衍生物E：13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：222.20，175.88，142.58，140.74，133.06，125.68，124.80，120.33，115.70，60.29，55.56，54.31，48.77，48.47，48.45，41.94，40.21，40.02，39.63，38.63，37.33，28.86，22.46，20.47，19.95，19.43，15.77。HRAMLC?MS/MS：m/z：419.2692（9）[M+H]+（calcdforC27H34N2O2，419.2693）。

2.2 異甜菊醇衍生物抗心肌細胞氧化應激損傷保護作用

2.2.1 不同濃度H2O2對H9c2細胞活力和LDH釋放率的影響 細胞培養上清中乳酸脫氫酶（LDH）的含量，可以反映細胞膜的完整程度，細胞損傷發生時，細胞膜遭破壞，通透性增加，更多的LDH會釋放到細胞外。從圖2可見，用100~500μmol/L H2O2處理H9c2心肌細胞2 h，細胞存活率及乳酸脫氫酶LDH釋放顯示出H2O2濃度依賴性，經500μmol/L H2O2處理后，細胞活力顯著下降至42%（P<0.01），細胞膜完整性被嚴重破壞，LDH濃度為Control組的4.7倍，細胞毒性明顯增加（P<0.01）。因此確定500μmol/L H2O2處理H9c2心肌細胞2 h作為后續實驗的條件，用于誘導H9c2細胞氧化應激損傷。

圖2 不同濃度H2O2對H9c2心肌細胞活力（A）和LDH釋放率（B）的影響Figure 2 Effects of different concentrations of H2O2 on H9c2 cardiomyocyte activity and release of LDH

2.2.2 不同衍生物預處理對細胞活力的影響 選擇H2O2相應濃度建立好穩定模型后，進一步研究不同衍生物預處理對細胞活力的影響，結果見圖3。可見，和空白對照組相比，加入500μmol/L H2O2后細胞存活率明顯降低；根據課題組前期研究顯示，5μmol/L是異甜菊醇鈉產生心臟保護作用的有效劑量[12?13]，因此，以該劑量作為衍生物活性初步篩選的給藥濃度。用5μmol/L的衍生物預處理后，與H2O2模型組相比，細胞存活率均有明顯增加（設對照為1，H2O2模型組細胞活力降低為對照組的26.16%，P<0.01；給藥組比模型組細胞活性增加量分別是：A：21.47%，不顯著；B：16.53%，P<0.01；D：9.76%，P<0.05；E：52.97%，P<0.05），以衍生物E作用最顯著。后續以不同濃度的衍生物E預處理進一步研究對H9c2細胞氧化應激損傷的保護作用。

圖3 不同衍生物預處理對H9c2心肌細胞活力的影響Figure 3 Effects of different isosteviol derivatives pretreat?menton H9c2 cardiomyocyte activity

2.2.3 不同濃度的衍生物E預處理對細胞活力的影響 從圖4可見，與H2O2模型組比較，在5~20μmol/L的衍生物E預處理后H9c2細胞存活率隨藥物濃度升高而降低（圖4A），進一步降低藥物濃度探討合適的給藥濃度。在1~10μmol/L預處理細胞后，與H2O2模型組相比，細胞存活率先與給藥濃度成正相關，給藥濃度為5μmol/L達到最高，隨后降低（圖4B）。綜合2個實驗濃度范圍的預處理結果發現，衍生物E給藥濃度為5μmol/L時對H9c2細胞的保護作用最明顯，因此采用5μmol/L作為后續實驗的藥物處理濃度。

圖4 不同濃度的衍生物E對H9c2細胞活力的影響Figure 4 Effects of Different Concentrations of Isosteviol Derivative Eon the cell viability of H9c2 cells

2.2.4 衍生物E預處理對細胞凋亡和壞死的影響為了檢測衍生物E能否抑制氧化應激誘導的H9c2細胞凋亡和壞死，采用AnnexinV?FITC/PI雙染法和流式細胞儀檢測了不同組中的細胞凋亡和壞死水平，結果見圖5。可見，與空白組相比，H2O2模型組細胞的凋亡率和壞死率都顯著上升，5μmol/L衍生物E預處理則顯著降低了細胞凋亡和壞死；同時，衍生物E單獨給藥組與空白組相比，細胞的凋亡率和壞死率沒有明顯的改變，表明5μmol/L衍生物E預處理細胞能夠抑制由H2O2誘導的H9c2細胞的凋亡和壞死。

圖5 衍生物E對氧化應激誘導的H9c2細胞凋亡和壞死的影響Figure 5 Effect of derivative Eon apoptosis and necrosis of H9c2 cells induced by oxidative stress

2.2.5 衍生物E預處理對氧化應激時H9c2細胞中的ROS水平的影響 為了檢測衍生物E是否會調節細胞內的活性氧ROS，用DCFH?DA熒光染料孵育細胞后，用流式細胞儀對細胞內ROS水平進行了檢測，結果見圖6?？梢?，與空白組相比，H2O2模型組中細胞內的ROS水平顯著上升，表明細胞氧化應激增強；與H2O2模型組相比，5μmol/L化合物預處理24 h則顯著降低了細胞ROS水平；衍生物E單獨處理24 h的細胞ROS水平與空白組相比沒有明顯的變化。

圖6 衍生物E對H2O2誘導的H9c2細胞氧化應激中ROS水平的影響Figure 6 Effect of derivative Eon ROSlevel in H2O2 induced oxidative stress in H9c2 cells

3 討論

細胞內的活性氧ROS包含了超氧自由基、羥基自由基和過氧化氫等[16]。氧化應激是ROS產生和體內抗氧化防御系統之間失衡的結果[17]。當氧化應激發生時，細胞內ROS水平升高，導致脂質、蛋白質和DNA受損，引起心肌細胞壞死和凋亡[18?19]。H2O2是一種相對穩定的氧自由基，H2O2誘導的細胞氧化應激是一種用于研究化合物或藥物對心臟疾病的潛在保護的廣泛使用的模型[20?25]。本課題前期研究發現，異甜菊醇可以增加H9c2細胞缺氧再灌注后的細胞活力、降低細胞內ROS水平、恢復線粒體形態及其膜電位，具有抑制細胞缺氧再灌注損傷的作用[11]；可通過抑制線粒體裂變蛋白表達，同時上調抗氧化因子硫氧還蛋白1（Trx1）和過氧化物酶2（Prdx2）的表達，從而降低ROS水平并恢復線粒體膜電位和形態的完整性[14]。本研究用500μmol/L H2O2處理H9c2心肌細胞2 h后，細胞的活力降低至約42%，LDH濃度則逐漸上升到對照組的4.7倍以上，細胞培養上清液中的LDH濃度反映了細胞膜的損傷程度，表明500μmol/L處理2 h能夠使H9c2細胞產生嚴重的損傷，氧化應激損傷模型構建成功。通過化學修飾在活潑位點C?15、C?16引入羥基羧基、在C?19引入苯并咪唑和3?氨基?2?羥基吡啶片段得到4個異甜菊醇衍生物A、B、D、E，經衍生物預處理后，細胞活力提升；5μmol/L衍生物E預處理細胞24 h后，細胞內ROS水平下調，細胞存活率提高25%，降低了由H2O2導致的H9c2細胞凋亡和壞死。綜上所述，異甜菊醇衍生物對H2O2誘導H9c2心肌細胞氧化損傷具有保護作用，其構效關系及抗氧化應激確切的作用機制尚需進一步研究。