制備方法對乳清分離蛋白-綠原酸共價接枝物結構和功能性質的影響

陳衛軍，劉東紅，李云成，孟凡冰，劉達玉

（1.成都大學食品與生物工程學院，四川 成都 610106；2.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）是生產干酪、酪蛋白等產品的副產物，主要成分為β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）等[1]。WPI營養價值高且具有優良的乳化性、凝膠性、起泡性和配體結合性等多種功能性質，不僅常作為一種功能性和活性成分廣泛應用于食品中[2]，也越來越多地作為載體材料用于構建生物活性物質的傳遞體系[3]。基于WPI可以構建乳液、納米復合物、凝膠等多種傳遞體系，但以單一蛋白質構建的傳遞體系通常存在化學穩定性較差、被包埋的生物活性物質容易發生氧化降解等不足[4]。研究證實，多酚的共價接枝可以賦予蛋白質優良的抗氧化活性，形成的蛋白質-多酚共價接枝物可作為一種抗氧化性載體材料，其構建的傳遞體系能夠有效提高被包埋生物活性物質的穩定性[5]。

多酚可以通過非酶促和酶促反應與蛋白質發生共價接枝，常用的方法有堿法、自由基法和酶法，不同方法所涉及的反應機理不同。其中，堿法和酶法是指在有氧條件下，多酚分別在堿性條件或酶的催化作用下首先被氧化成相應的醌，然后與蛋白質分子中的親核試劑（如賴氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和色氨酸等）結合，形成蛋白質-多酚共價接枝物。自由基法則是指通過自由基引發劑產生的自由基使蛋白質分子活化，活化的蛋白質分子再與多酚結合形成共價接枝物[6]。蛋白質和多酚的接枝反應過程十分復雜，反應底物和接枝方法都會影響產物結構和功能性質，進而影響其在傳遞體系構建中的應用。因此，需要系統研究底物種類、結構、分子大小等在不同條件下接枝對接枝物結構和功能性質的影響，以進一步明確其構效關系，為定向制備功能性專一的接枝物提供依據。

綠原酸（chlorogenic acid，CA）是一種廣泛分布于食用植物中的膳食多酚，具有優良的抗氧化活性和多種生物學特性[7]。據報道，CA的共價接枝能夠顯著改善蛋清蛋白、乳鐵蛋白、β-Lg等蛋白質的抗氧化活性，進而增強其構建傳遞體系的化學穩定性[4,6,8]。但是，關于CA與蛋白質的共價接枝多采用單一方法進行，不同方法之間的系統比較尚鮮見報道。因此，本實驗以WPI和CA為原料，分別采用堿法、自由基法和酶法誘導其共價接枝，系統比較不同方法制備的WPI-CA共價接枝物在接枝效率、結構和功能性質上的差異，以期為制備理想的抗氧化性載體材料以用于傳遞體系的構建提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白（蛋白質質量分數93%、水分質量分數4.5%、乳糖質量分數0.2%、脂肪質量分數1%、灰分質量分數2%） 美國Hilmar公司；CA（純度98%）、多酚氧化酶（活力≥500 U/mg干質量）、水溶性VE（Trolox）、三吡啶基三嗪（2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine，TPTZ）、2,2’-偶氮-二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）（純度98%） 上海市阿拉丁試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、福林-酚（H＋濃度2 mol/L）、5,5’-二硫硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、2,2’-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate，ABTS）、8-苯氨基萘-1-磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma-Aldrich公司；o-鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、過硫酸鉀、H2O2溶液（體積分數30%）、硝酸、Tris、甘氨酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、脲、碳酸鈉、乙酸、甲醇、三氯化鐵（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司；J1500圓二色光譜儀 日本Jasco公司；Cary Eclipse熒光分光光度計 美國瓦里安公司；ZCEC-130263F差示掃描量熱儀、FE20K pH計、GB204電子天平瑞士Mettler Toledo公司；UV-2550紫外-可見分光光度計日本島津公司；MultiskanTMGO酶標儀 美國Thermo Scientific公司；磁力攪拌器 金壇市富華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI-CA共價接枝物的制備

堿法和自由基法接枝均參考劉夫國[6]的方法，酶法接枝參考Prigent等[9]的方法。

堿法接枝：以超純水溶解制備質量濃度20 mg/mL的WPI溶液，加入質量分數0.02%疊氮化鈉溶液抑制微生物生長。采用0.2 mol/L NaOH溶液將WPI溶液pH值調節至9.0，4 ℃下溶脹過夜。取pH 9.0 WPI溶液與0.70 mmol/L CA溶液（超純水配制）等體積混合，再次調節pH值至9.0。該混合液于室溫下敞口攪拌反應24 h，然后轉移至透析袋（截留分子質量3 500 Da）內，4 ℃下于超純水中透析48 h（每隔6 h換一次超純水）。透析后的溶液冷凍干燥即得WPI-CA共價接枝物。

自由基法接枝：以超純水溶解制備質量濃度10 mg/mL的WPI溶液，加入質量分數0.02%疊氮化鈉溶液抑制微生物生長，4 ℃下溶脹過夜。向100 mL上述溶液中依次加入1 mL 5 mol/L H2O2溶液和0.25 g VC，室溫下反應2 h。然后向反應液中加入一定量CA使其終濃度為0.35 mmol/L，繼續反應24 h。反應結束后將溶液轉移至透析袋（截留分子質量3 500 Da）內，4 ℃下于超純水中透析48 h（每隔6 h換一次水），透析后的溶液冷凍干燥即得WPI-CA共價接枝物。

酶法接枝：以超純水溶解制備質量濃度10 mg/mL的WPI溶液，加入質量分數0.02%疊氮化鈉抑制微生物生長，于4 ℃下溶脹過夜。向WPI溶液中加入一定量的多酚氧化酶（10 U/mL），用0.2 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.0，室溫下攪拌2 h。向反應液中加入一定量CA使其終濃度為0.35 mmol/L，繼續反應24 h后加入5 μmol/L NaHSO3終止反應。然后將溶液轉移至透析袋（截留分子質量3 500 Da）內，4 ℃下于超純水中透析48 h（每隔6 h換一次水），透析后的溶液冷凍干燥即得WPI-CA共價接枝物。

所得3 種WPI-CA共價接枝物均通過凱氏定氮法測定其中的WPI含量，用于后續實驗樣品溶液配制。

1.3.2 自由氨基含量的測定

參考文獻[10]報道的OPA法測定樣品自由氨基含量。OPA試劑的配制（現配現用）：將40 mg OPA溶于1 mL甲醇，與25 mL 10 mmol/L四硼酸鈉溶液、2.5 mL質量分數20% SDS溶液和0.1 mLβ-巰基乙醇混合后用超純水定容至50 mL。將4 mL OPA試劑與0.2 mL樣品溶液（WPI質量濃度0.2 mg/mL）混合后于35 ℃下反應2 min，然后測定其在340 nm波長處的吸光度。以L-賴氨酸繪制標準曲線，計算樣品中自由氨基含量。

1.3.3 巰基含量的測定

參考Chen Weijun等[11]的方法測定樣品中巰基含量。用Tris-甘氨酸緩沖液（86 mmol/L Tris、90 mmol/L甘氨酸、4 mmol/L EDTA、8 mol/L尿素和0.5 g/100 mL SDS，pH 8.0）配制WPI質量濃度為2 mg/mL的樣品溶液。將5 mL樣品溶液與0.05 mL Ellman試劑（含4 mg/mL DTNB的Tris-甘氨酸緩沖液）混合，室溫下避光反應1 h后測定其在412 nm波長處的吸光度（A412nm）。巰基含量按式（1）計算。

式中：ρ為樣品溶液中WPI質量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 游離色氨酸含量的測定

向0.9 mL 1 mg/mL樣品溶液中加入1 mL 16 mol/L硝酸溶液，混合后于50 ℃下水浴加熱15 min，快速冷卻后依次加入4 mL 5 mol/L氫氧化鈉溶液和4 mL無水乙醇，充分混合后分別于360 nm和430 nm波長處測定吸光度。色氨酸質量濃度按式（2）計算。

1.3.5 CA接枝量的測定

采用福林-酚法測定接枝物中CA接枝量。將0.5 mL 1 mg/mL樣品溶液與2.5 mL福林-酚試劑混合后于室溫下避光反應5 min，向混合液中加入2 mL 7.5 g/100 mL碳酸鈉溶液，漩渦混勻后繼續避光反應2 h，然后測定反應液在760 nm波長處的吸光度。樣品溶液吸光度需扣除相同質量濃度WPI溶液在相同反應條件下的吸光度。通過CA標準曲線計算樣品中CA含量，結果用每克樣品所含CA物質的量表示，單位為μmol/g。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將2 mg樣品與0.5 g溴化鉀充分混勻、研磨、壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm－1范圍內進行掃描。分辨率設置為4 cm－1，結果采用OMNIC軟件導出。

1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參考Chen Weijun等[12]的方法，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析接枝對蛋白分子質量的影響。采用質量分數5%濃縮膠和12%分離膠，以Tris-甘氨酸緩沖液（pH 8.3）作為電泳液。樣品溶液（2 mg/mL）經上樣緩沖液稀釋5 倍后于沸水中加熱5 min，冰浴冷卻后取適量樣品上樣。電泳結束后，用考馬斯亮藍R-250染色凝膠，以脫色液（V（甲醇）∶V（冰乙酸）∶V（水）＝5∶4∶1）進行脫色。

1.3.8 圓二色光譜分析

參考Yin Zhucheng等[13]的方法分析樣品二級結構，并做適當調整。取適量樣品溶于pH 7.0 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中得到WPI質量濃度為0.25 mg/mL的樣品溶液，室溫下用圓二色光譜儀在190～260 nm波長范圍內進行掃描，掃描速率50 nm/min，比色皿光程1 mm。以PBS作為空白，WPI二級結構組成采用DichroWeb數據庫分析。

1.3.9 內源熒光光譜分析

取適量樣品溶于pH 7.0 10 mmol/L PBS中得到WPI質量濃度為0.25 mg/mL的樣品溶液，室溫下用熒光分光光度計分析其內源熒光光譜。激發波長280 nm，發射波長范圍300～450 nm，狹縫寬度均設置為5 nm。

1.3.10 表面疏水性測定

采用ANS熒光探針法分析[14]。用10 mmol/L PBS（pH 7.0）配制WPI質量濃度為0.005～0.5 mg/mL的樣品溶液。向4 mL樣品溶液中加入50 μL 8 mmol/L ANS溶液，混勻后在激發熒光波長365 nm下測定發射波長484 nm處的熒光強度。以熒光強度對WPI質量濃度作圖，所得曲線初始段斜率即為WPI表面疏水性指數（H0）。

1.3.11 熱學特性分析

參考文獻[6]的方法采用差示掃描量熱儀測定樣品的熱學特性。稱取約6.0 mg樣品置于鋁盤中并密封，鋁蓋中央扎孔，以空盤作為對照。氮氣流速30 mL/min，升溫范圍3～160 ℃，升溫速率10 ℃/min。利用TA60軟件分析樣品的變性溫度。

1.3.12 抗氧化活性分析

樣品抗氧化活性的測定參考支梓鑒[15]的方法，并作適當修改。

DPPH自由基清除能力：將0.5 mg/mL樣品溶液與0.2 mol/L DPPH-乙醇溶液等體積混合，室溫下避光反應30 min后測定其在517 nm波長處吸光度。

鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）：將0.1 μmol/L乙酸緩沖液（pH 3.6）、0.02 μmol/L三氯化鐵和0.01 μmol/L TPTZ溶液（用0.04 μmol/L鹽酸配制）按體積比10∶1∶1混合制備Fe3＋-TPTZ試劑，現配現用。將0.5 mg/mL樣品溶液與Fe3＋-TPTZ試劑等體積混合，37 ℃下振蕩反應10 min后測定其在593 nm波長處的吸光度。

ABTS陽離子自由基清除能力：將18 mg ABTS和4 mg過硫酸鉀分別溶于4 mL超純水中，二者混合搖勻后避光反應16 h得ABTS儲備液。取3 mL ABTS儲備液用無水乙醇定容至100 mL得到ABTS工作液。將1 mL 0.5 mg/mL樣品溶液與3 mL ABTS工作液混合，室溫下反應1 h后測定混合溶液在734 nm波長處的吸光度。

氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）：用75 mmol/L PBS（pH 7.4）配制質量濃度0.2 mg/mL樣品溶液和40 mg/mL AAPH溶液。將50 μL樣品溶液和50 μL 0.5 μmol/L熒光素鈉鹽溶液混合于黑色96 孔板中，37 ℃下孵育15 min后迅速加入100 μL AAPH溶液，振蕩5 s，用酶標儀于激發波長485 nm、發射波長538 nm下每2 min測定一次熒光強度，共測定2 h。通過軟件計算熒光素鈉鹽熒光衰變曲線下積分面積。

4 種方法分別建立Trolox標準曲線，所有結果均以每克樣品所含Trolox物質的量表示，單位為μmol/g。

1.3.13 乳化特性分析

參考文獻[11]報道的方法測定接枝物乳化性質。用10 mmol/L PBS（pH 7.0）溶解樣品，制備WPI質量濃度2.0 mg/mL的樣品溶液。取15 mL樣品溶液加入5 mL大豆油，13 500 r/min均質2 min后分別于0 min和10 min從底部取100 μL乳液，用質量濃度0.1 g/100 mL SDS溶液稀釋100 倍后于500 nm波長處測定其吸光度。分別根據式（3）、（4）計算其乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsion stability index，ESI）。

式中：A0和A10分別為均質后0 min和10 min時的吸光度；ρ為WPI質量濃度/（g/mL）；φ為油相體積分數/%；n為稀釋倍數。

1.4 數據處理與分析

所有實驗均設置3 組平行，所得數據采用SPSS 22軟件以鄧肯新復極差法進行顯著性分析，顯著水平為5%，運用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 WPI和WPI-CA接枝物中反應基團含量和接枝量分析結果

據報道，多酚可與蛋白分子中的自由氨基、色氨酸和游離巰基等發生共價結合而形成蛋白質-多酚共價接枝物[16]。因此，本實驗測定反應前后這3 種反應基團含量的變化。由表1可知，與WPI相比，接枝物的自由氨基、色氨酸和游離巰基含量均顯著降低（P＜0.05）。自由氨基含量測定中使用的SDS會破壞蛋白分子間的非共價相互作用，而在游離巰基分析中使用的尿素可以抑制巰基向二硫鍵的轉換。因此，共價接枝物中自由氨基、色氨酸和游離巰基含量的降低表明這些基團與CA發生了共價結合。這3 種反應基團中自由氨基參與共價結合的量最多，這可能是因為其在WPI中的含量最高。本實驗結果與文獻[5,17]報道的結果一致。與WPI相比，不同方法制備的接枝物中各反應基團的減少量從高到低依次為酶法接枝物＞堿法接枝物＞自由基法接枝物。劉夫國[6]發現，在制備乳鐵蛋白-CA接枝物時堿法的接枝率明顯高于自由基法。這可能是因為不同制備方法的反應原理和反應條件不同。

表1 WPI和WPI-CA接枝物中自由氨基、色氨酸、游離巰基含量和CA接枝量Table 1 Free amino, tyrosine and thiol group and CA contents of WPI and WPI-CA conjugates

由表1可知，WPI-CA接枝物中CA接枝量與反應基團含量變化趨勢相反，即參與反應的氨基酸基團越多，CA接枝量越高。以堿法、自由基法和酶法制備的接枝物中CA接枝量分別為（52.70±1.81）、（42.57±1.85）μmol/g和（63.75±2.50）μmol/g。表明酶法在誘導WPI與CA的共價接枝反應中效率最高，其次為堿法和自由基法。

2.2 WPI和WPI-CA接枝物的傅里葉變換紅外光譜分析結果

由圖1可知，WPI光譜中在3 289、2 928、1 651 cm－1和1 532 cm－1處的主要吸收峰分別代表其中存在的酰胺A帶（N—H伸縮）、酰胺B帶（C—H伸縮）、酰胺I帶（C＝O伸縮）和酰胺II帶（N—H彎曲和C—N伸縮）[18]。與WPI相比，采用堿法、自由基法和酶法制備的WPI-CA共價接枝物位于3 289 cm－1處的吸收峰分別發生了10、4 cm－1和15 cm－1的紅移，而位于1 532 cm－1處的吸收峰均發生了6 cm－1的紅移，說明WPI的氨基參與了接枝反應。這與文獻[6]報道的結果一致。

圖1 WPI和WPI-CA接枝物的傅里葉變換紅外光譜Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of WPI and WPI-CA conjugates

2.3 WPI和WPI-CA接枝物的SDS-PAGE分析結果

由圖2可知，WPI主要存在α-La和β-Lg兩種蛋白條帶。與WPI相比，WPI-CA接枝物中α-La和β-Lg的條帶均輕微向上遷移，說明CA的接枝使WPI分子質量增大，且每個蛋白分子共價連接的CA數量有限。這些高分子質量的接枝物并未被電泳過程中使用的SDS或β-巰基乙醇所分解，說明WPI-CA接枝物是由WPI與CA通過共價鍵結合而形成[19]。相關研究指出，α-La/溶菌酶/BSA/乳鐵蛋白-CA接枝物中約共價結合有2～4 個CA分子[9,17]，與本實驗結果類似。

圖2 WPI和WPI-CA接枝物的電泳圖譜Fig. 2 SDS-PAGE profiles of WPI and WPI-CA conjugates

2.4 WPI和WPI-CA接枝物的圓二色光譜分析結果

采用圓二色光譜分析CA的共價接枝對WPI二級結構的影響，并通過DichroWeb數據庫分析WPI和WPI-CA接枝物的二級結構含量。由表2可知，與WPI相比，WPI-CA接枝物的α-螺旋相對含量明顯降低，而無規卷曲相對含量明顯增加，說明CA的共價接枝導致WPI分子結構的解聚。魏子淏[5]和Wu Xuli等[19]分別在β-Lg-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和β-Lg-EGCG/CA接枝物的相關研究中證實了這一現象。此外，不同方法制備的WPI-CA接枝物二級結構含量變化程度也不同。堿法和自由基法制備的WPI-CA接枝物二級結構含量變化程度較大，而酶法制備WPI-CA接枝物二級結構含量變化程度較小。這可能是不同接枝方法的反應條件不同導致。堿法接枝過程中，由于反應體系pH值長時間偏離WPI等電點，導致WPI分子產生部分不可逆的伸展，破壞其α-螺旋結構，增加分子無序程度[20]。自由基法接枝體系中高活性羥自由基（·OH）進攻蛋白質分子則可能會引起α-螺旋向β-折疊和無規卷曲的轉變[21]。而酶法反應條件溫和，pH值接近中性，所以其接枝物二級結構含量變化最小。

表2 WPI和WPI-CA接枝物的二級結構相對含量Table 2 Secondary structure contents of WPI and WPI-CA conjugates

2.5 WPI和WPI-CA接枝物的內源熒光光譜分析結果

通過內源熒光光譜分析蛋白質熒光基團周圍微環境的變化研究其三級結構變化。蛋白質內源熒光主要來自色氨酸和酪氨酸，這兩種氨基酸在280 nm激發波長下均能發射熒光[22]。由圖3可知，與WPI相比，WPI-CA接枝物的熒光強度明顯降低，其中酶法接枝物降低程度最大，其次為堿法接枝物。熒光強度的降低一方面是因為部分色氨酸參與了接枝反應；另一方面則是因為CA的苯環與WPI熒光基團相互作用對熒光產生猝滅作用[6]。雖然3 種接枝物中參與反應的色氨酸殘基量沒有顯著差異（P＞0.05），但酶法接枝物中的CA接枝量最大（表1），因此對WPI熒光的猝滅作用也最強。此外，由圖3還可發現，CA的共價接枝使WPI的最大熒光發射波長紅移4～5 nm，該結果與Feng Jin等[23]的研究結果一致。說明與CA的接枝反應改變了WPI的分子結構，導致其熒光基團微環境極性增加[24]。

圖3 WPI和WPI-CA接枝物的內源熒光光譜圖Fig. 3 Intrinsic fluorescence spectra of WPI and WPI-CA conjugates

2.6 WPI和WPI-CA接枝物的表面疏水性分析結果

采用ANS熒光探針法分析CA的共價接枝對WPI表面疏水性的影響。由圖4可知，堿法和酶法接枝會顯著降低WPI的H0（P＜0.05），而自由基法接枝則顯著提高WPI的H0（P＜0.05）。多酚的共價接枝對蛋白質表面疏水性的影響主要有兩方面[25]：一是由于含有親水性羥基，多酚的共價接枝會增加蛋白質的親水性；二是接枝過程中蛋白分子內部的一些疏水性基團可能會暴露，導致H0增加。因此，由于反應條件不同，不同方法制備的WPI-CA接枝物H0變化趨勢不同。魏子淏[5]報道，采用堿法誘導EGCG的共價接枝會顯著降低乳蛋白的H0（P＜0.05）。Feng Jin等[23]研究則發現，與卵白蛋白相比，采用自由基法制備的卵白蛋白-兒茶素接枝物H0顯著升高（P＜0.05）。這可能是因為自由基法接枝過程中·OH的氧化作用會促進蛋白質分子解折疊，使分子內部一些疏水性氨基酸暴露，導致其H0增加[26]。

圖4 WPI和WPI-CA接枝物的表面疏水性Fig. 4 Surface hydrophobicity of WPI and WPI-CA conjugates

2.7 WPI和WPI-CA接枝物的熱穩定性分析結果

采用差示掃描量熱法分析CA共價接枝對WPI熱穩定性的影響，由圖5可知，WPI的熱變性溫度為94.00 ℃，而堿法接枝物、自由基法接枝物和酶法接枝物的熱變性溫度分別為96.67、93.17 ℃和97.67 ℃，說明接枝方法會影響WPI-CA接枝物的熱穩定性，這可能是因為不同接枝方法制備的接枝物結構存在差異。Ali等[27]研究發現，采用酶法和堿法誘導5-咖啡酰奎尼酸的共價接枝會顯著提高β-Lg的熱變性溫度，但會導致其變性焓（ΔH）降低，推測這可能是因為5-咖啡酰奎尼酸的共價結合使β-Lg的某些區域部分展開，使得ΔH降低并提高其他區域的穩定性，從而導致更高的熱變性溫度。劉夫國[6]在采用自由基法和堿法制備乳鐵蛋白-CA/EGCG/沒食子酸接枝物時也得出相似結論。但也有研究指出，堿法制備的BSA-CA接枝物[28]和自由基法制備的卵白蛋白-兒茶素接枝物[23]的熱變性溫度和ΔH均低于對照蛋白。綜上，蛋白質-多酚共價接枝物的熱穩定性不僅受制備方法的影響，還可能與底物種類相關。

圖5 WPI和WPI-CA接枝物的差示掃描量熱圖譜Fig. 5 Differential scanning calorimetric analyses of WPI and WPI-CA conjugates

2.8 WPI和WPI-CA接枝物的抗氧化活性分析結果

蛋白質-多酚共價接枝物由于多酚的接入而具有優良的抗氧化活性。由表3可知，WPI的抗氧化活性較弱，而CA的共價接枝可以將其抗氧化活性提高至1.29～27.79 倍，表明CA的共價接枝可以顯著增強WPI的抗氧化活性（P＜0.05）。不同方法所制備WPI-CA共價接枝物的抗氧化活性由大到小依次為酶法接枝物＞堿法接枝物＞自由基法接枝物，這與WPI-CA接枝物中的CA接枝量分析結果（表1）一致，表明蛋白質-多酚接枝物的抗氧化活性取決于其多酚接枝量，這與文獻[6]的結果一致。

表3 WPI和WPI-CA接枝物的抗氧化活性Table 3 Antioxidant activities of WPI and WPI-CA conjugates

2.9 WPI和WPI-CA接枝物的乳化性分析結果

由圖6可知，與WPI相比，WPI-CA共價接枝物的EAI和ESI均顯著提高（P＜0.05），說明CA的共價接枝改善了WPI的乳化性質。這與Sui Xiaonan等[29]關于大豆分離蛋白-花青素接枝物的研究結果一致。對于接枝物乳化性能的提高，一方面，可能是因為多酚的共價接枝增強了蛋白質在油-水界面的表面張力，使其形成的乳液粒徑更小；另一方面，多酚的共價接枝提高了蛋白質分子Zeta電勢，從而增強乳液液滴間的排斥力，提高乳液穩定性[30]。此外，共價接枝物結構更為松散，這也有利于其乳化性能的改善。

圖6 WPI和WPI-CA接枝物的乳化性質Fig. 6 Emulsifying properties of WPI and WPI-CA conjugates

3 結 論

本研究以堿法、自由基法和酶法制備WPI-CA共價接枝物，系統比較了不同方法的接枝效率及其對接枝物結構和功能性質的影響。結果表明：3 種方法均能誘導WPI-CA接枝物的形成，但酶法接枝效率最高，其次為堿法；CA的接枝會改變WPI的二級結構、三級結構和表面親疏水性，其中酶法接枝對WPI二級結構影響最小；自由基法接枝能夠提高WPI的表面疏水性，其他2 種方法則相反；堿法和酶法接枝能夠提高WPI的熱穩定性，而自由基法則相反。與WPI相比，接枝物的抗氧化活性和乳化性質均顯著增強，且抗氧化活性與CA接枝量成正比。酶法接枝物的熱穩定性和抗氧化活性最好。