柳葉白前粗多糖組成、形貌特征及抗氧化研究

李可昕 王翔 劉莘然 劉洋

〔摘要〕 目的 提取獲得柳葉白前粗多糖（CSP90），對其單糖組成、形貌特征和抗氧化活性進行分析。方法 通過水提醇沉法提取CSP90，利用HPLC測定單糖組成，通過掃描電子顯微鏡分析形貌特征，并測定CSP90對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除作用。結果 CSP90的糖含量和蛋白質含量分別為94.7%和2.86%，主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，其微觀結構的聚集狀態部分呈凹凸不平的不規則薄碎片狀結構，邊緣不平整，而部分結構呈光滑連綿的薄片，伴有一些分支，說明CSP90呈無定形結構。在1.6 mg·mL-1的濃度下，CSP90與抗壞血酸（VC）對DPPH自由基的清除率分別為96.5%和97.6%，表明CSP90具有較好的DPPH自由基清除活性。結論 CSP90含有多種單糖，并且對DPPH自由基的清除能力較好，有望被開發成一種天然的抗氧化劑。

〔關鍵詞〕 柳葉白前;多糖;單糖;形貌特征;抗氧化性

〔中圖分類號〕R284;R285? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.06.003

Study on Composition， Morphological Characteristics and Antioxidant Activity of Crude Polysaccharide from Cynanchum Stauntonii

LI Kexin1， WANG Xiang1， LIU Xinran2， LIU Yang3*

（1. Graduate School， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 301617， China; 2. School of Chinese Materia Medica， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 301617， China; 3. Chinese Medical College， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 301617， China）

〔Abstract〕 Objective The crude polysaccharides were extracted and purified from Cynanchum stauntonii （CSP90）， and the monosaccharide composition， morphological characteristics and antioxidant activities were analyzed. Methods CSP90 was obtained by water extraction and alcohol precipitation. The monosaccharides composition of CSP90 was determined by high-performance liquid chromatography （HPLC）. The morphological characteristics were analyzed by scanning electron microscopy. While the 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） radical scavenging activity of CSP90 was further determined. Results The sugar and protein contents of CSP90 were 94.7% and 2.86%， respectively. CSP90 was mainly composed of glucose， galactose， and arabinose. Some of the microstructures of CSP90 were irregular and thin fragments with uneven edges， while some of the microstructures were smooth and continuous slices with some branches， indicating that CSP90 had an amorphous structure. At a concentration of 1.6 mg·mL-1， the scavenging rates of DPPH radical by CSP90 and ascorbic acid （VC） were 96.5% and 97.6%， indicating that CSP90 had better DPPH radical scavenging activity. Conclusion CSP90 contained a variety of monosaccharides and had a good DPPH radical scavenging ability. It is hoped that CSP90 will be developed into a natural antioxidant.

〔Keywords〕 Cynanchum stauntonii; polysaccharide; monosaccharide; morphological characteristics; antioxidant activity

人體在生命活動中會不斷地產生自由基，健康的人體中自由基的產生與清除維持著動態平衡，一旦平衡被破壞，人體就可能受到氧化損傷[1]。研究[2]表明，炎癥、衰老等常常與人體產生的過量自由基有關，所以為保證人體健康，人們不斷開發具有抗氧化作用的藥品、食品和保健品。多糖是一種由單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子化合物，常分布于天然植物、動物及微生物中，是生命活動中不可缺少的物質[3]?，F代藥理學研究[3-4]發現多糖具有抗炎、抗腫瘤、抗高血壓、抗氧化及提高免疫力等作用，其中抗氧化作用一直是多糖藥理學研究的熱點之一。

藥典收載的白前來源有兩種，包括蘿藦科植物柳葉白前[Cynanchum stauntonii （Decne.） Schltr.ex

Lévl.]和芫花葉白前[Cynanchum glaucescens（Decne.） Hand.-Mazz.]，以根莖和根入藥，具有降氣、消痰、止咳的作用，常用于治療肺氣壅實、咳嗽痰多等癥狀[5]?，F有報道中關于柳葉白前的成分研究主要集中于甾體類、高級脂肪酸、植物甾醇和揮發性成分，而對于白前多糖的研究較少[6-8]。當前藥材市場中常常將白薇、白射干、徐長卿和老瓜頭藥材與白前混用[9]，鑒定這些藥材的化學成分能夠減少用藥的錯誤，保證臨床用藥的安全性。為進一步發掘柳葉白前多糖成分的組成和活性，本研究通過水提醇沉法提取粗多糖，采用HPLC進行單糖組成分析，同時利用掃描電子顯微鏡觀察多糖的形貌特征，并進行初步的體外抗氧化檢測，為進一步研究柳葉白前多糖提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1? 材料、儀器與試劑

柳葉白前藥材購自河北安國中藥材市場，由南開大學郭遠強教授對飲片進行了物種鑒定，確定為蘿藦科植物柳葉白前的干燥根及根莖。I2000型數字電子天平（深圳市無限量衡器有限公司）;紫外分光光度計（PerkinElmer公司）;Quanta 200掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）;LC-3000高效液相色譜儀（北京創新恒通科技有限公司）。甘露糖（批號：DST180130-047，純度≥98.0%）、葡萄糖醛酸（批號：DST190226-016，純度≥98.0%）、半乳糖醛酸（DST190325-065，純度≥98.0%）、葡萄糖（批號：DST180817-041，純度≥98.0%）、半乳糖（批號：DST190320-168，純度≥98.0%）、巖藻糖（批號：DST-180325-566，純度≥98.0%）均購于德思特生物技術有限公司（成都）;鼠李糖（批號：815A035，純度≥98.0%）、木糖（批號：1228A023，純度≥98.0%）、阿拉伯糖（批號：718G043，純度≥99.0%）購于Solarbio科技有限公司（北京）。三氟乙酸（TFA）（批號：T103291）和VC（批號：A103533）購自阿拉丁試劑有限公司（上海），1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（批號：P109105）購自國藥集團化學試劑有限公司（上海），乙腈為色譜純，其他化學藥品和試劑均為分析純。

1.2? 柳葉白前多糖的提取與純化

采用水提醇沉法對柳葉白前多糖進行提取，稱取柳葉白前藥材500 g，在室溫下經水浸泡12 h后，以1∶10的料液比在90 ℃煎煮提取3次，每次3 h。過濾除去藥材殘渣后，合并上清液并減壓濃縮得到600 mL溶液。得到的濃縮液經過無水乙醇沉淀至終濃度為90%，在4 ℃放置12 h后，離心得到139 g 90-沉淀。將90-沉淀溶解在1 600 mL蒸餾水中，加入400 mL Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），轉移至分液漏斗中，劇烈振搖后，靜置5 h等待分層。分層結束后，棄去中下層的蛋白和有機試劑，再加入400 mL Sevag試劑重復除蛋白2次。濃縮上層的多糖溶液，分裝進透析袋中（截留分子量：8 kDa），經去離子水透析2 d后，將透析袋內液體通過旋轉蒸發儀濃縮至30 mL，真空凍干后即得柳葉白前粗多糖，標記為CSP90。

1.3? 糖含量的測定

采用改良苯酚-硫酸法[10]測定CSP90的糖含量：吸取0.4 mg·mL-1葡萄糖溶液各加0、20、40、60、80、100、120、140、160 μL于試管內，加蒸餾水補足至200 μL備用。配制0.1 mg·mL-1 CSP90樣品溶液，取200 μL備用。向葡萄糖溶液和CSP90溶液中各加入100 μL苯酚溶液，搖勻，迅速加入1 mL濃硫酸，搖勻，室溫靜置30 min，在490 nm處測定吸光度。實驗平行測定3次，記錄數據，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線y=3.060 3 x+0.024 3，R2=0.999 8，依據樣品的吸光度計算出糖含量。

1.4? 蛋白質含量測定

參照劉玉明等[11]的方法配置成含有0.01%考馬斯亮藍G-250、4.7%乙醇和8.5%磷酸的混合溶液備用。配制1 mg·mL-1的牛血清白蛋白標準溶液，4 ℃保存備用。吸取0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08、0.10 mL蛋白標準液，加入蒸餾水補足至0.1 mL。再避光加入5 mL考馬斯亮藍混合溶液，充分混勻。將溶液在30 ℃反應5 min，冷卻至室溫后，于595 nm處測定吸光度。同時配制5 mg·mL-1的CSP90樣品溶液，取0.1 mL按上述步驟處理，測定吸光值。實驗平行測定3次，記錄數據。以蛋白溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線y=0.905 9 x+0.032 6，R2=0.999 9，依據樣品的吸光度計算出蛋白質含量。

1.5? 全波長掃描檢測

全波長掃描常用來測定多糖中是否有蛋白質和核酸殘留，當多糖溶液在260 nm和280 nm中未觀察到吸收峰時，說明多糖中不含核酸和蛋白質[12]。配制0.2 mg·mL-1的CSP90溶液，通過紫外分光光度計在200～400 nm進行全波長掃描，分析得到圖譜。

1.6? 單糖組成分析

單糖組成依據Zhang等[13]的方法進行檢測，根據圖譜中的色譜峰時間和峰面積計算出樣品的單糖組成及比例。將4 mg CSP90與2 mL TFA（2 mol·L-1）在120 ℃下油浴6 h，得到多糖水解液，再加入100 μL PMP甲醇溶液（0.5 mol·L-1）和100 μL NaOH溶液（0.3 mol·L-1），標記為樣品溶液，備用。標準品的處理如下：配置2 mmol·L-1甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖的單糖標準品溶液各50 μL，分別加入500 μL NaOH溶液（0.3 mol·L-1）和500 μL PMP甲醇溶液（0.5 mol·L-1），混勻后備用。將樣品和標準品溶液在70 ℃的水浴鍋中反應30 min，冷卻后，在樣品溶液中加入105 μL鹽酸（0.3 mol·L-1）溶液，標準品溶液中各加入510 μL鹽酸（0.3 mol·L-1）溶液中和，再分別加入等體積的氯仿溶液，劇烈震搖后，離心，去除氯仿層，反復萃取兩次。取上層水相經0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液經HPLC分析（Kromasil 100-5-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液-乙腈（83∶17）為流動相，進樣體積為20 μL，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長設定為250 nm。將CSP90和標準單糖的圖譜進行對比分析。

1.7? 形貌特征分析

掃描電子顯微鏡是一種觀察大分子物質形貌特征的重要工具，通過捕獲樣品表面的電子信號形成圖像，成像清晰，立體效果好[14]。參照張淑杰等[15]的方法，采用掃描電鏡對CSP90的形貌特征進行分析。將凍干的CSP90樣品用導電膠帶粘在樣品臺上，并鍍上一層金粉。通過掃描電子顯微鏡在15 kV加速電壓下捕獲圖像，放大倍數選擇400、800和1 600倍，選取適當的視野進行拍照記錄。

1.8? DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力的試驗根據Wang等[16]的方法，稍做改動。分別配制0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg·mL-1濃度的VC溶液及CSP90樣品溶液，0.1 mmol·L-1的DPPH-無水乙醇溶液。配置樣品組A1為1 mL CSP90+1 mL DPPH-乙醇溶液，A2為1 mL CSP90+1 mL無水乙醇溶液;對照組A1為1 mL VC+1 mL DPPH-乙醇溶液，A2為1 mL VC+1 mL無水乙醇溶液;空白組A0為1 mL去離子水+1 mL DPPH-乙醇溶液。將各組溶液混合均勻后，室溫暗處理30 min，用紫外分光光度計在517 nm處測定吸光度。實驗平行測定3次，記錄數據。通過Graphpad軟件（Prism 7.0）計算半數清除率（IC50）。DPPH自由基清除率的計算公式：RCSP90=[A0-（A1-A2）]/A0×100%;RVC=[A0-（A1-A2）]/A0×100%。

2 結果

2.1? CSP90中糖含量和蛋白含量

以柳葉白前藥材重量（500 g）為標準，計算CSP90的提取率為5.56%。CSP90的糖含量測定通過苯酚-硫酸法進行顯色，紫外分光光度計測定吸光度，對3次重復試驗的數據進行分析，計算出CSP90的糖含量為94.7%，說明提取的多糖純度較高。通過考馬斯亮藍染色法測定蛋白質的含量，對3次重復實驗的數據進行分析，計算出CSP90中蛋白質含量為2.86%。

2.2? CSP90中核酸與蛋白質殘留檢測

通過紫外分光光度儀對0.2 mg·mL-1的CSP90溶液在200～400 nm進行全波長掃描，如圖1所示，在260 nm處無明顯吸收，說明核酸含量接近于0;在280 nm處有微弱吸收，說明有少量蛋白質殘存，這與蛋白質含量計算結果也相符合。

2.3? CSP90的單糖組成檢測

通過HPLC對CSP90進行單糖分析，與標準單糖的色譜圖對比，如圖2所示，根據出峰時間和峰面積計算出CSP90含有的單糖及摩爾比例為甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=0.03∶0.02∶0.04∶1.00∶0.12∶0.37。CSP90中葡萄糖的含量最高，占總糖的比例達到65.81%;其次是阿拉伯糖的含量，占20.27%;半乳糖、半乳糖醛酸、甘露糖、鼠李糖含量分別為7.63%、2.88%、1.97%、1.43%。

2.4? CSP90的形貌特征檢測

通過掃描電鏡觀察CSP90的形態特征和微觀結構。如圖3A、3B所示，在放大400倍下，發現部分CSP90微觀結構的聚集狀態呈凹凸不平的不規則薄碎片狀結構，邊緣不平整，而部分結構呈光滑連綿的薄片，伴有一些分支。在放大800倍下（圖3C），觀察到部分多糖呈光滑平整的薄片形狀同時可見分支呈長桿柱狀。繼續放大1 600倍下（圖3D），觀察到部分多糖表面厚度不均，有凹陷、波峰，可見圓球狀顆粒。

2.5? CSP90體外抗氧化能力檢測

對CSP90進行DPPH自由基清除實驗，以VC為陽性對照，設置0.05～1.6 mg·mL-1濃度梯度進行實驗。結果如圖4所示，CSP90具有一定的DPPH自由基清除能力，并且隨著濃度的增加，清除能力有所增強。隨著濃度從0.05 mg·mL-1增加到0.8 mg·mL-1，CSP90對DPPH自由基的清除率從46.5%增加到93.4%。在1.6 mg·mL-1的濃度下，CSP90與VC對DPPH自由基的清除率分別為96.5%和97.6%，表明在此濃度下兩者清除能力的差別很小。通過Graphpad軟件計算IC50值為0.083 mg·mL-1，CSP90對DPPH自由基具有良好的清除作用。

3 討論

通過掃描電鏡觀察CSP90的微觀結構時，發現部分多糖呈光滑平整的薄片狀，說明分子之間作用較強，結合緊密[17-18]。Shi等[19]從大葉冬青中純化出一種均一多糖（ILP50-2），通過掃描電鏡進一步觀察微觀結構，發現ILP50-2在聚合狀態下呈分支不規則網狀結構，表面不平整，表明多糖具有無定形結構，在放大400倍和800倍下觀察，發現ILP50-2厚度不均勻，呈凹陷和凸起，推測可能是ILP50-2的分支結構引起的。觀察IL50-2和CSP90的掃描電鏡圖譜有部分相似，推測CSP90中的部分多糖也存在分支結構。

DPPH自由基是一種穩定的自由基，在乙醇溶液中呈紫色，在此體系中加入抗氧化劑后，DPPH自由基可以很容易地接受抗氧化劑提供的氫原子，形成穩定的分子后紫色溶液就會變成無色或淺黃色[16，20]。初步的體外抗氧化實驗結果表明CSP90的IC50值為0.083 mg·mL-1，在較低的濃度下就有較好的DPPH自由基清除活性，有望被開發為一種天然的抗氧化劑。該實驗結果為更深入的研究柳葉白前多糖的結構和活性提供了理論依據。

水提醇沉法提取多糖具有提取液澄明，操作簡單，成本低，儀器設備常見的優點[21]。隨著科學技術的發展，出現了越來越多提取多糖的新型方法，包括微波萃取法，加速溶劑萃取法，生物酶解法等等[21-23]。相比于水提醇沉法，新型提取法具有提取效率高，提取效果好的優點[21]。期望今后的實驗可以采用更多新型方法提取得到柳葉白前多糖，對比水提醇沉法進行分析，繼續優化柳葉白前多糖的提取工藝。

參考文獻

[1] 胡一鴻，葉? 龍，朱術超，等.番荔枝種子粗多糖抗氧化能力研究[J]. 熱帶作物學報，2011，32（6）：1051-1054.

[2] 吳? 靜，胡居吾，熊? 偉，等.樟樹不同器官中多糖抗氧化、免疫調節活性的研究[J].江西農業大學學報，2019，41（4）：804-813.

[3] CHEN F， HUANG G L. Preparation and immunological activity of polysaccharides and their derivatives[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2018， 112： 211-216.

[4] 郭元亨，張利軍，曹麗麗，等.植物多糖中單糖組成分析技術的研究進展[J].食品科學，2018，39（1）：326-332.

[6] WANG K M， LI A， ZHANG R L， et al. Five new steroidal glycosides from the roots of Cynanchum stauntonii[J]. Phytochemistry Letters， 2016， 16： 178-184.

[7] 李婷婷.柳葉白前化學成分及其抗氧化活性研究[D].延吉：延邊大學，2015.

[8] 田效民，李? 鳳，黃順菊，等.柳葉白前揮發性成分的GC-MS分析[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（5）：111-113.

[9] 林? 好，陳鏡安，李斯璐，等.白前及其混偽品的ITS2分子鑒定[J]. 中藥材，2017，40（11）：2531-2536.

[10] DUBOIS M， GILLES K A， HAMILTON J K， et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry， 1956， 28（3）： 350-356.

[11] 劉玉明，錢甜甜，蔣定文，等.凱氏定氮法和考馬斯亮藍法測定方格星蟲多糖中蛋白質的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（19）：96-98.

[12] 張遙遙，張? 夢，胡? 悅，等.黃精多糖的提純、硫酸化和羧甲基化修飾及其抗氧化活性研究[J].食品工業科技，2019，40（21）：45-51.

[13] ZHANG S J， ZHANG Q， AN L J， et al. A fructan from Anemarrhena asphodeloides Bunge showing neuroprotective and immunoregulatory effects[J]. Carbohydrate Polymers， 2020， 229： 115477.

[14] 凌? 妍，鐘嬌麗，唐曉山，等.掃描電子顯微鏡的工作原理及應用[J].山東化工，2018，47（9）：78-79，83.

[15] 張淑杰，權威，姜宏偉，等.不同純化程度豌豆水溶性多糖的電鏡掃描分析[J].農業生物技術學報，2019，27（10）：1822-1830.

[16] WANG M C， ZHU P L， ZHAO S W， et al. Characterization， antioxidant activity and immunomodulatory activity of polysaccharides from the swollen culms of Zizania latifolia[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2017， 95： 809-817.

[17] 倪德江，陳玉瓊，謝筆鈞，等.烏龍茶多糖OTPS 2-1的光譜特性、形貌特征及熱特性研究[J].高等學?；瘜W學報，2004，25（12）： 2263-2268.

[18] 宮春宇，徐? 碩，徐先梅，等.超濾分離制備玉米須粗多糖的分析及促益生菌增殖活性研究[J/OL].食品與發酵工業：1-8 [2021-04-16].https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.026296.

[19] SHI Z Y， AN L J， ZHANG S J， et al. A heteropolysaccharide purified from leaves of Ilex latifolia displaying immunomodulatory activity in vitro and in vivo[J]. Carbohydrate Polymers， 2020， 245： 116469.

[20] HAN N， WANG L， SONG Z H， et al. Optimization and antioxidant activity of polysaccharides from Plantago depressa[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2016， 93： 644-654.

[21] 趙躍東，曹春琪，葉永山，等.水提醇沉法及其替代方法的研究進展[C]//中華中醫藥學會中藥化學分會第九屆學術年會論文集（第一冊）.廈門：2014：316-322.

[22] 周偉娥，周學鋒，王宇陽，等.中藥多糖成分前處理及檢測方法研究進展[J].分析測試學報，2020，39（9）：1168-1175.

[23] 魏曉楠，郝鐵成.中藥提取新技術研究進展[J].中國野生植物資源，2020，39（9）：47-50.