硼處理根瘤菌接種液對紫花苜蓿根、莖、葉中可溶性糖含量的影響

陳永崗，師尚禮，吳 芳，康文娟，張輝輝，阿 蕓，李興龍，陳建剛

（甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是利用價值最高的豆科牧草之一，其在保持土壤水分以及作為動物飼料原料等方面具有重要作用[1]。根瘤菌可與苜蓿形成共生關系，在苜蓿根部結瘤固氮，還可以定殖于組織中[2]。但在苜蓿與根瘤菌的相互作用過程中，會誘發苜蓿的免疫反應，阻礙根瘤菌的侵入[3]，使部分根瘤菌難以與苜蓿形成共生關系。因此如何減弱宿主的防御反應，促進苜蓿與根瘤菌的侵染效率對于實際生產具有重要意義。而與外源菌相比，內生菌在與苜蓿建立共生關系時占有明顯優勢[4]，因此研究內源根瘤菌與外源根瘤菌侵染苜蓿以及侵染成功后在體內運移和定殖機理對于苜蓿和根瘤菌共生關系的建立有重要意義。

可溶性糖在植物體內的功能是多方面的，不僅參與調節植物生長、發育、抗性形成等多個生理過程，還參與胞內信號調節與轉導過程[5]，對于苜蓿和根瘤菌共生關系建立具有重要作用。研究發現，可溶性糖在植物細胞結構和物質代謝中起著重要作用[6]。苜蓿植株體內根瘤菌定殖數量隨植株光合產物源–庫的運輸方向呈逐漸增大的趨勢[7]。微量元素在植物體內可溶性糖的運輸、合成以及植物的生殖生長等過程中扮演重要角色[8]，其中硼元素是植物生長所必需的微量元素，缺乏或者過量都對植物的生長及其功能的發揮有很大的影響[7,9]。研究發現，缺硼不僅會影響植物葉片中碳水化合物的含量，同時還會影響碳水化合物在植物體內的轉運和代謝[10-11]。而高硼，會抑制植物根的生長，降低植物體內蛋白質含量，同時影響糖的代謝途徑[12]。硼的生理作用主要是易與植物組織中游離態的糖結合，使糖帶有極性，易通過質膜，促進糖轉運[13]。因此研究硼濃度對苜蓿接種根瘤菌后，不同取樣時期苜蓿體內可溶性糖的變化對于研究硼處理根瘤菌接種紫花苜蓿影響和調整各組織中可溶性糖積累與重新分布有重要意義。

本研究擬以不同硼濃度處理內生熒光蛋白標記菌SinorhizobiummelilotiLZgn5f 菌液以及外源熒光蛋白標記菌S.meliloti12531f 菌液后，接種甘農5 號紫花苜蓿。研究不同硼處理內源外源根瘤菌培養液接種紫花苜蓿后，同一取樣時期苜蓿根莖葉中可溶性糖含量的動態變化，以期篩選適宜的硼濃度，同時為硼處理根瘤菌接種紫花苜蓿影響和調整各組織中可溶性糖積累與重新分布規律及機理研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根瘤菌：熒光標記外源根瘤菌S. meliloti12531f(12531f)，由甘肅農業大學教育部草業生態系統重點實驗室提供，其原始菌株S. meliloti12531 購自中國科學院微生物保藏中心的中華苜蓿根瘤菌；熒光標記內源根瘤菌S. melilotiLZgn5f (gn5f)，分離自甘農5 號紫花苜蓿種子。

硼酸(H3BO3)：購自國藥集團化學試劑有限責任公司，含量不少于99.5%。

培養基：采用TY 培養基進行菌株的活化、保存及培養。培養基配方如下：酵母粉 3 g·L-1，胰蛋白胨5 g·L-1，CaCl2·6H2O 1.33 g·L-1，蒸餾水 1 L，pH 7.0。固體培養基加瓊脂16 g·L-1。

甘農5 號紫花苜蓿(Gangnong No.5)種子由甘肅農業大學教育部草業生態系統重點實驗室提供，凈度為97%，發芽率為86%。

營養液：Hoagland 有氮營養液[14]和Hoagland 無氮營養液[15]，以1 mol·L-1的HCl 溶液調節營養液pH至中性。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的配制

設置硼濃度梯度為0、0.05、1、5、10 和100 mg·L-1。將硼酸置于小燒杯中，在無菌操作臺內紫外殺菌30 min 后，用無菌水溶解并過濾滅菌3 次。按濃度梯度將硼酸加入已配置好的40 mL TY 液體培養基中，設置3 個重復。

1.2.2 根瘤菌液的配置

根瘤菌菌液配制參考文獻[16]的方法進行，即將斜面保存的兩種熒光標記供試菌株（12531f 和gn5f）活化后接種到50 mL TY 液體培養基中，28 ℃，180 r·min-1培養至對數期，將兩種菌液按10%濃度分別加入到1.2.1 已配置好的含有不同濃度梯度硼酸的40 mL TY 液體培養基中。將上述菌液培養至對數期后，轉移至50 mL 離心管，10 000 r·min-1離心10 min，保留沉淀，加入等體積的無菌水，在旋渦震蕩儀上充分打散，制成待用菌懸液，備用。

1.2.3 苜蓿培養

2018 年3 月- 6 月，在甘肅農業大學草業學院采用沙培法進行苜蓿培養。試驗過程具體參考文獻[16-17]的方法進行：選用清洗干凈并高溫滅菌的細沙，裝入底部扎有小孔的塑料杯(直徑9 cm，深11 cm)中，放入水培盒(長、寬和高分別為31、19 和10.5 cm)中。每杯播種45 粒甘農5 號紫花苜蓿種子(用碘伏浸泡3 min)，表面覆蓋1.5 cm 滅菌細沙。未接種根瘤菌菌液前，每隔7 d 向水培盒中澆灌700 mL有氮營養液，發芽以前用無菌蒸餾水補充水分，保證幼苗的正常生長。

1.2.4 苜蓿根部根瘤菌接種

苜蓿根部根瘤菌接種參考文獻[15]的方法進行：待紫花苜蓿幼苗長出真葉后，每杯定苗25 株，將上述4 種已配好的30 mL 菌懸液分別澆于上述對應盆栽表面，以單獨澆灌等量無菌水處理為對照(CK)，每處理重復3 次。接種后每隔7 d 每盒澆灌700 mL 無氮營養液，分別在幼苗生長到30、60 和90 d時進行取樣。

1.2.5 苜蓿各組織可溶性糖的測定

幼苗生長至30、60 和90 d 后每個處理隨機選取5 株，擦凈表面污物，將根、莖、葉分離，剪碎混勻。測定方法參考文獻[18]的方法進行。

1.3 數據處理

采用SPSS 20 軟件進行方差分析，并用Duncan法對各測定數據進行多重比較，顯著性水平為0.05。用Excel 2010 軟件進行數組處理以及作圖，所有數據采用3 個重復的平均值 ± 標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 硼處理根瘤菌接種液對不同取樣時期苜蓿根、莖、葉中可溶性糖含量的影響

2.1.1 硼處理根瘤菌接種液對不同取樣時期苜蓿根中可溶性糖含量的影響

不添加硼單獨接種根瘤菌12531f 處理30 d 后，根中可溶性糖含量高出對照12.29%，隨硼濃度的增加可溶性糖含量呈先降低后增加再降低的趨勢，硼濃度為1 mg·L-1時，可溶性糖含量達最高，顯著高出對照27.23% (P＜ 0.05)，但與單獨接菌處理之間無顯著差異(P＞ 0.05) (表1)；60 d 后，無硼添加組根中可溶性糖含量顯著低于對照(P＜ 0.05)，可溶性糖含量隨硼濃度的增加呈先上升再下降又上升的趨勢，硼濃度為1 mg·L-1，可溶性糖含量最高，此濃度下，可溶性糖含量較對照和單獨接菌處理顯著提高了67.01%和92.93% (P＜ 0.05)；90 d 后，無硼添加組的根中的可溶性糖含量顯著低于對照(P＜ 0.05)，隨硼濃度的增加可溶性糖含量呈先上升再下降又上升的趨勢，硼濃度為1 mg·L-1時，可溶性糖含量達最高，顯著高出對照和單獨接菌處理24.05%和62.50%(P＜ 0.05)。

表1 硼處理根瘤菌12531f 接種后苜蓿根莖葉中可溶性糖變化Table 1 Changes of soluble sugar in alfalfa roots, stems and leaves after inoculating 12531f with boron treatment

不添加硼單獨接種根瘤菌gn5f 處理30 d 后，根中可溶性糖含量低于對照(P＞ 0.05)，隨硼濃度的增加可溶性糖含量呈先上升再下降又上升的趨勢(表2)，硼濃度為100 mg·L-1時，可溶性糖含量顯著高于對照和單獨接菌處理33.4%和45.56% (P＜ 0.05)；60 d后，根中可溶性糖含量較對照促進作用不顯著(P＞ 0.05)，可溶性糖含量隨硼濃度增加呈先上升后下降再上升的趨勢，硼濃度為100 mg·L-1時，根中可溶性糖含量最高，顯著高于對照和單獨接菌處理57.18%和54.62% (P＜ 0.05)；90 d 后，根中可溶性糖含量顯著高于對照14.96% (P＜ 0.05)，隨硼濃度的增加可溶性糖含量呈先上升后下降又上升的趨勢，硼濃度為100 mg·L-1時，根中可溶性糖含量最高，較對照和單獨接菌處理顯著提高26.98%和14.13%(P＜ 0.05)。

表2 硼處理根瘤菌gn5f 接種后苜蓿根莖葉中可溶性糖變化Table 2 Changes of soluble sugar in alfalfa roots, stems and leaves after inoculating gn5f with boron treatment

綜上所述，1 mg·L-1硼處理接種外源菌12531f，更有利于根中可溶性糖的積累；100 mg·L-1硼處理內源菌gn5f 接種更有利于根中可溶性糖的積累。

2.1.2 硼處理根瘤菌接種液對不同取樣時期苜蓿莖中可溶性糖含量的影響

不添加硼單獨接種根瘤菌12531f 處理30 d 后，莖中可溶性糖含量顯著高出對照30.26% (P＜ 0.05)，隨著硼濃度的增加可溶性糖含量呈先增加后降低的趨勢，硼濃度為1 mg·L-1時，莖中可溶性糖含量達最高，顯著高出對照和單獨接菌處理49.13%和27.05% (P＜ 0.05) (表1)；60 d 后，莖中可溶性糖含量低于對照(P＞ 0.05)，可溶性糖含量隨硼濃度的增加呈先上升再下降又上升的趨勢，硼濃度為1 mg·L-1時，莖中可溶性糖含量最高，顯著高出對照和單獨接菌59.85%和66.34% (P＜ 0.05)；90 d 后，莖中可溶性糖含量顯著低于對照(P＜ 0.05)，隨硼濃度的增加可溶性糖含量呈先下降后上升再下降又上升的趨勢，硼濃度為100 mg·L-1時，莖中可溶性糖含量達最大，較對照和單獨接菌處理顯著高出16.87%和58.02%(P＜ 0.05)。

不添加硼單獨接種根瘤菌gn5f 處理30 d 后，莖中可溶性糖含量顯著高出對照47.24% (P＜ 0.05)(表2)，隨硼濃度的增加可溶性糖含量呈先上升后下降再上升又下降的趨勢，硼濃度為1 mg·L-1時，莖中可溶性糖含量達最高，顯著高出對照和單獨接菌處理59.56%和23.36% (P＜ 0.05)；60 d 后，莖中可溶性糖含量較對照促進作用不顯著(P＞ 0.05)，隨硼濃度增加呈先下降后上升再下降的趨勢，硼濃度為5 mg·L-1時，莖中可溶性糖含量達最高，顯著高出對照和單獨接菌處理46.33%和39.49% (P＜ 0.05)；90 d 后，莖中可溶性糖含量低于對照(P＞ 0.05)，隨硼濃度的增加可溶性糖含量呈先上升后下降又上升的趨勢，硼濃度為100 mg·L-1時，莖中可溶性糖含量達最高，顯著高出對照和單獨接菌處理18.62%和22.17% (P＜ 0.05)。

上述結果表明，1 mg·L-1硼處理接種外源菌12531f有利于莖中可溶性糖的積累；100 mg·L-1硼處理接種內源菌gn5f 有利于可溶性糖在莖中的積累。

2.1.3 硼處理根瘤菌接種液對不同取樣時期苜蓿葉中可溶性糖含量的影響

不添加硼接種根瘤菌12531f 處理30 d 后，葉中可溶性糖含量低于對照(P＞ 0.05)，隨硼濃度的增加可溶性糖含量呈先上升后下降再上升的趨勢，硼濃度為100 mg·L-1時，葉中可溶性糖含量最高，高出對照和單獨接菌處理13.10%和29.24% (P＞ 0.05) (表1)；60 d 后，葉中可溶性糖含量顯著高出對照41.45%(P＜ 0.05)，隨硼濃度的增加可溶性糖含量呈先下降后上升的趨勢，添加硼不利于可溶性糖在葉中積累；90 d 后，葉中可溶性糖含量低于對照(P＞ 0.05)，隨硼濃度的增加可溶性糖含量呈先上升后下降的趨勢，硼濃度為1 mg·L-1時，葉中可溶性糖含量達最高，顯著高出對照和單獨接菌處理7.63%和11.96%(P＞ 0.05)。

不添加硼接種根瘤菌gn5f 處理30 d 后，葉中可溶性糖含量高出對照16.19%，但不顯著(P＞ 0.05)，隨硼濃度的增加葉中可溶性糖含量呈先下降后上升再下降的趨勢，硼濃度為1 mg·L-1時，葉中可溶性糖含量最高，顯著高出對照和單獨接菌處理40.70%和29.24% (P＜ 0.05)；60 d 后，葉中可溶性糖含量較對照促進作用不顯著，隨硼濃度增加可溶性糖含量呈先下降再上升又下降的趨勢，硼濃度為1 mg·L-1時，葉中可溶性糖含量達最高，顯著高于對照和單獨接菌處理35.96%和26.4% (P＜ 0.05)；90 d 后，葉中可溶性糖含量顯著高于對照62.49% (P＜ 0.05)，隨硼濃度的增加可溶性糖含量呈先下降后上升又下降的趨勢，添加硼不利于可溶性糖在葉中積累(表2)。

由上可知，硼處理接種菌株12531f 不利于葉中可溶性糖的積累；硼處理接種菌株gn5f 不利于葉中可溶性糖積累。

2.2 硼處理根瘤菌接種液接種苜蓿后同一取樣時期根、莖、葉中可溶性糖含量變化

2.2.1 硼處理菌株培養液接種30 d 后苜蓿根、莖、葉中可溶性糖含量變化

硼處理兩根瘤菌菌液接種30 d 后，苜蓿根、莖、葉中可溶性糖含量動態變化各不相同(表1、表2)。其中，硼處理根瘤菌12531f 接種30 d 后，當硼濃度小于1 mg·L-1時，更有利于促進可溶性糖向莖中積累，當硼濃度大于1 mg·L-1時，更有利于促進可溶性糖向根中積累，硼對葉中可溶性糖含量影響最小；硼處理根瘤菌gn5f 接種更有利于可溶性糖向莖中積累，當硼濃度為1 mg·L-1時促進作用最顯著，硼濃度為100 mg·L-1時，更有利于可溶性糖向根中積累。

這表明，適宜的硼處理兩菌株接種30 d 后，可以顯著促進可溶性糖向根或莖中運輸積累。

2.2.2 硼處理兩菌株培養液接種60 d 后苜蓿根莖葉中可溶性糖含量動態變化

硼處理兩根瘤菌12531f 和gn5f 菌液接種60 d 后苜蓿根莖葉中可溶性糖含量的變化各不同(表1、表2)。其中，接種不添加硼的12531f，更有利于可溶性糖向葉中積累，添加1 mg·L-1硼接種更有利于葉中可溶性糖向莖和根中運輸和積累，當硼濃度大于5 mg·L-1時，硼對可溶性糖的變化影響逐漸減弱；當硼濃度小于1 mg·L-1時，接種根瘤菌gn5f，更有利于促進可溶性糖向葉中積累，當硼濃度為100 mg·L-1時，更有利于葉中可溶性糖向根和莖中運輸積累。

上述結果表明，1 mg·L-1硼處理菌株12531f 和100 mg·L-1硼處理菌株gn5f 接種，均有利于可溶性糖向根和莖中運輸積累。

2.2.3 硼處理兩菌株接種90 d 后苜蓿根莖葉中可溶性糖含量動態變化

添加不同硼濃度的兩根瘤菌接種液接種90 d后對苜蓿根、莖、葉中可溶性糖含量的動態變化影響各不相同(表1、表2)。其中，接種添加硼處理的根瘤菌菌株12531f，更有利于促進可溶性糖向根中運輸積累，當硼濃度為1 mg·L-1時，促進用作最明顯，當硼濃度為100 mg·L-1時，更有利于可溶性糖向莖中運輸積累；不同硼濃度處理接種根瘤菌菌株gn5f 均可以促進可溶性糖向根中運輸積累，但當硼濃度為100 mg·L-1時，更有利于向莖和根中運輸積累，且促進作用最明顯。

3 討論

3.1 不同硼處理根瘤菌12531f 和gn5f 接種液接種30 d 后對苜蓿根、莖、葉中可溶性糖含量的影響

硼是植物生長發育和維持細胞壁結構以及功能發揮的必需微量元素[19]，其在植物生長發育過程中扮演者重要的角色，可以直接作用于細胞膜，并參與可溶性糖在植物體內的運輸[20]。本研究中也發現適宜的硼處理兩根瘤菌接種30 d 后，可以促進可溶性糖在根和莖中的積累，并且保持根、莖、葉中可溶性糖含量的動態平衡。這是因為適宜硼處理根瘤菌接種可以提高宿主體內與糖轉運及合成有關酶的活性，繼而促進可溶性糖在根和莖中合成和積累[21]，為植物生長提供能量。豆科植物根系是植物對硼和根瘤菌最敏感的部位，研究發現接種根瘤菌有利苜蓿根中可溶性糖的積累[22]，這與本研究結果一致。本研究發現接種30 d 時，外源根瘤菌根中可溶性糖含量高于對照，而內源菌低于對照，這可能是由于苜蓿根部對不同來源的根瘤菌的親和力不同；也有可能是由于根瘤菌的群體效應所引起的[23]。1 mg·L-1硼處理12531f 和100 mg·L-1硼處理gn5f 培養液接種30 d時，更有利于根中可溶性糖的積累，表明不同的根瘤菌對硼濃度的敏感性不同[16]，同時硼可以提高根部氧氣含量，促進根系生長[24]，有利于糖分的積累，促進果實生長[25]。曾小紅等[26]也發現不同來源的根瘤菌對植物組織中代謝產物含量影響有差異。

3.2 不同硼處理根瘤菌12531f 和gn5f 培養液接種60 d 后對苜蓿根、莖、葉中可溶性糖含量的影響

可溶性糖是綠色植物碳代謝的重要產物，可間接反映植物光合作用能力與碳代謝的關系，硼對光合產物在植物體內的分配和運轉起著重要作用，同時可以調節植物各組織中有機物質的供應[27]。本研究中也發現，適宜硼處理兩菌株接種苜蓿60 d 后，可以促進可溶性糖在根和莖中的積累，這可能是由于苜蓿在該時期光合作用較強，合成的可溶性糖較多，從而使大量的可溶性糖從葉中被運輸到根、莖中積累而產生的結果；劉金燕[12]研究發現硼濃度對小麥(Triticum aestivuml)根影響的差異蛋白主要是參與轉錄、蛋白質翻譯和加工以及糖代謝等途徑相關的蛋白，繼而調控與糖代謝有關的代謝通路。接種根瘤菌與對照相比，接種12531f 的根和莖中可溶性糖含量低于對照，而內源菌gn5f 高于對照，表明內源外源根瘤菌對根和莖中可溶性糖的積累影響不同。這可能與根瘤菌在植物體內運移和定殖的數量有關[16]，同時李莎莎等[22]研究也發現接種根瘤菌有利苜蓿根內可溶性糖的積累。

本研究還發現，添加不同硼濃度的內源菌和外源菌接種液接種苜蓿對根和莖中可溶性糖積累影響不同，可能是因為不同的根瘤菌對硼的敏感性不同，繼而影響庫源之間化合物的運輸[28-29]，最終導致苜蓿根、莖、葉中可溶性糖含量的動態變化不一致。

3.3 不同硼處理根瘤菌12531f 和gn5f 接種液接種90 d 后對苜蓿根、莖、葉中可溶性糖含量的影響

本研究發現，接種90 d 時，硼處理培養液有利于內源根瘤菌gn5f 葉中可溶性糖的積累，是由于內源菌侵染效率比外源菌高[16]，易于在苜蓿體內運移定殖，此外，不同來源的根瘤菌對葉中可溶性糖的作用也不相同[26]，因而內源根瘤菌對苜蓿葉中可溶性糖積累影響較大。1 mg·L-1硼處理外源菌12531f和100 mg·L-1硼處理內源菌gn5f 接種液接種時，更有利于促進苜蓿根、莖中可溶性糖的積累，劉鵬[30]研究發現，適量的硼能明顯減少可溶性糖在功能葉中的積累，促進光合產物從葉向莖的運輸，莖中可溶性糖含量增加[31]，這可能是導致本研究不同硼濃度處理兩菌株接種90 d 后，產生不同結果的部分原因。同時高硼會抑制葉中可溶性糖的積累，可能是因為硼影響植株硼糖絡合物形成進而影響碳水化合物的運輸而引起的[32]；也可能是由于高硼脅迫使葉片部分細胞膜結構和功能受損，從而生成大量可溶性糖來調節滲透壓平衡[7,33]，導致葉中可溶性糖含量減少。具體機制有待進一步研究。

由上述可以得出，植物組織中可溶性糖代謝途徑是一個復雜的生理生化過程，硼和根瘤菌處理均對其含量有一定的影響，適宜的硼處理根瘤菌接種有利于可溶性糖在苜蓿根和莖中積累，不同的根瘤菌對苜蓿體內可溶性糖的積累影響不同。本研究初步探究了添加不同硼濃度的內源外源根瘤菌接種液接種甘農5 號紫花苜蓿后，在不同取樣時期苜蓿根莖葉中可溶性糖含量的動態變化，為硼處理根瘤菌接種紫花苜蓿影響和調整各組織中可溶性糖積累與重新分布規律及機理研究提供理論依據。

4 結論

1)內源外源根瘤菌對甘農5 號花苜蓿根莖葉中可溶性糖含量的影響不同。

2) 1 mg·L-1硼與外源菌12531f 接種，有利于根和莖中可溶性糖的積累；100 mg·L-1硼與內源菌gn5f接種，有利于根和莖中可溶性糖的積累。