扁蓿豆MrERF1 的轉錄激活活性、亞細胞定位及表達分析

雷雨晴，張業猛，王海慶

（1. 中國科學院高原生物適應與進化重點實驗室 / 中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 青海省作物分子育種重點實驗室，青海 西寧 810001）

干旱、寒冷、高鹽和水淹等非生物脅迫是影響植物生長發育和地理分布的重要環境脅迫因子。當受到外界環境的脅迫時，植物會啟動多種信號途徑，激活轉錄因子的表達[1]。轉錄因子通過調控一系列下游靶基因的表達在植物應對不利環境脅迫時發揮重要作用[2]。植物在進化的過程中產生了脫落酸(abscisic acid，ABA)、鈣離子和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等信號轉導途徑[3]。ABA 與植物干旱、高鹽和寒冷等脅迫密切相關，除了通過調節植物的氣孔和促進植物體內滲透調節物質的積累來幫助植物適應逆境脅迫外，還參與植物體內離子濃度平衡的調節[4]。ABA信號轉導途徑可通過激活下游轉錄因子參與植物逆境脅迫調控[5]。擬南芥(Arabidopsis thaliana) AtABR1轉錄因子是參與調控ABA 信號途徑的乙烯應答因子(ethylene responsive factor，ERF)亞家族成員，Choi等[6]研究表明MAP3K16 可通過磷酸化激活AtABR1轉錄因子。

植物中抵抗逆境脅迫相關的轉錄因子有AP2(APETALA 2)/ERF、WRKY、MYB、NAC 和bZIP 等[7]。AP2/ERF 轉錄因子超家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，包括AP2、ERF、RAV(Related to ABI3/VP1)、DREB (dehydration-responsive element binding protein)和Soloist 亞家族。ERF 亞家族僅包含一個保守的AP2結構域，可與下游基因啟動子的GCC-box 結合[8]，在植物響應病原菌侵染、高鹽、干旱、損傷、低氧和高低溫等脅迫時發揮重要調控作用[9-10]。例如，外源性內皮素、ABA 和鈣離子可誘導簇毛麥(Haynaldia villosa)ERF1-V的表達，在小麥(Triticum aestivum)中過表達ERF1-V提高了小麥對白粉菌的抗性和對鹽、干旱脅迫的耐受性，表明ERF1-V通過參與生物和非生物脅迫的不同信號轉導途徑發揮作用[11]；Zhuo 等[12]從黃花苜蓿(Medicago falcata)中克隆到MfERF1基因，MfERF1的過表達增強了轉基因植株的抗寒性和抗氧化活性，進一步研究表明MfERF1可通過調節多胺轉運、提高抗氧化酶活性和促進脯氨酸積累來提高轉基因植株的抗寒性。此外，ERF 亞家族還參與植物的生長發育和代謝調控。例如，SmERF115是丹參(Salvia miltiorrhiza)中次級代謝產物酚酸生物合成的正向調節轉錄因子，SmERF115 通過與SmRAS1基因啟動子中的GCC-box 結合激活其表達來控制酚酸的生物合成[13]；擬南芥中的ERF 亞家族成員AtABR1 轉錄因子能夠響應創傷信號并誘導生長素的合成，促進根的再生[14]。解析ERF 轉錄因子亞家族成員在植物逆境響應中的功能，對于揭示植物適應逆境機制和農作物抗逆改良具有重要的理論價值和應用前景。

扁蓿豆(Medicago ruthenica)為豆科(Leguminosae)苜蓿屬矩莢苜蓿組的多年生草本植物[15]，分布于西伯利亞、蒙古國和我國北方高緯度高寒地區[16-17]。其枝葉繁茂，葉片柔軟，營養價值高，適口性好，與黃花苜蓿和紫花苜蓿(Medicago sativa)相比，扁蓿豆對包括干旱、寒冷等不利環境具有更強的耐受性，是有望在紫花苜蓿等苜蓿屬栽培種無法越冬地區人工馴化利用的優質豆科牧草資源[18]。趙麗麗等[19]通過相對發芽率、相對活力指數和半致死滲透脅迫強度3 個指標對扁蓿豆和黃花苜蓿進行抗旱性鑒定，結果表明在種子萌發期4 份扁蓿豆種質材料的抗旱性均強于黃花苜蓿；于潔等[20]利用復鹽溶液模擬鹽脅迫對10 份不同地區的野生紫花苜蓿和扁蓿豆材料進行耐鹽性綜合評價，通過灰色關聯分析法和加權隸屬函數法等分析表明，扁蓿豆萌發期的耐鹽性較紫花苜蓿強。

目前對扁蓿豆的抗逆性研究多集中在形態解剖、生長發育以及生理生化水平[21-22]，在分子水平上解釋扁蓿豆適應極端逆境的機制，發掘逆境適應相關基因，對于苜蓿屬栽培種的抗逆改良具有重要的參考價值。過去10 年中，高通量測序技術的快速發展和檢測成本的不斷下降，為分離和分析非模式植物中逆境相關基因的功能提供了方便。本研究根據此前低溫脅迫轉錄組測序分析結果，在對青藏扁蓿豆中的一個編碼AP2/ERF 轉錄因子基因MrERF1轉錄激活活性和亞細胞定位分析的基礎上，對其在多種非生物脅迫下的表達模式進行了分析。所獲得的結果為今后鑒定該基因在非生物脅迫下的功能提供了信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

扁蓿豆種子由中國農業科學院草原研究所孫啟忠研究員提供。將種子用98%濃硫酸處理8 min，無菌水沖洗多次去除殘余的硫酸后，置于鋪有濕濾紙的培養皿上于4 ℃暗處理24 h，而后轉移到21 ℃、16 h光照/8 h 黑暗條件下萌發。3 d 后將發芽種子移栽于蛭石 ∶ 營養土(3 ∶ 1)的混合基質中培養。生長3 周后對幼苗進行非生物脅迫和脫落酸處理。將幼苗置于4 ℃、16 h 光照/8 h 黑暗條件的培養箱中進行低溫處理；將整株幼苗洗凈后，轉移到鋪有多層吸透200 mmol·L-1NaCl 溶液的吸水紙的培養皿中進行高鹽脅迫處理；脫落酸處理將整株幼苗轉移到鋪有多層吸水紙的培養皿中，用含有0.05% Tween20 (V/V)的50 μmol·L-1脫落酸溶液噴霧后，封蓋以防植株脫水；干旱處理將整株幼苗轉移到培養皿中，在室溫條件下進行自然脫水；水淹處理將整株幼苗轉移到培養皿中并淹沒于水中；對照組將整株幼苗轉移到鋪有多層吸水紙的培養皿中。上述處理在不同時間分別對整株幼苗、幼苗地上部分和根進行取樣，液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存備用。此外，將處于開花期的扁蓿豆植株于4 ℃處理8 h 后，收集根、莖、葉、頂芽和花序樣品，用于不同器官中的基因轉錄水平檢測。

1.2 MrERF1 基因cDNA 克隆與序列分析

總RNA 提取使用TRIzol 試劑進行，提取的總RNA按照說明利用Recombinant DNase I (TaKaRa，大連)處理去除基因組DNA，cDNA 第一鏈的合成按照M-MuLV 逆轉錄試劑盒(生工，上海)的說明操作。根據本實驗室前期扁蓿豆低溫脅迫轉錄組測序結果，設計正向引物MrERF-F(5′-TGAAGAGGGACAAG AACTATCG-3′)和反向引物MrERF-R(5′-AATCA TAACGGAAGTAGGGACC-3′)，以4 ℃處理8 h 幼苗的cDNA 為模板，使用PyrobestDNA 聚合酶(TaKaRa，大連)進行擴增，擴增產物膠回收后，連接到pBluescript Ⅱ SK+/-載體進行測序。

利用DNAMAN8.0 軟件分析核酸序列、編碼的氨基酸序列以及開放閱讀框；通過NCBI 網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行蛋白序列相似性檢索，利用網址(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)查找保守結構域；利用WoLF PSORT網站(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)進行核定位信號預測[23]；ExPASy 的ProtParam 程序(http://web.expasy.org/protparam/)用于對蛋白質理化性質進行分析；通過SignalP5.0 Server 網站 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預測該蛋白是否有信號肽；在擬南芥網站(https://www.arabidopsis.org)進行MrERF1保守結構域序列的相似性檢索；通過MEGA7.0 軟件中Neighbor-Joining 法構建系統進化樹，對各個節點的檢驗使用自舉法(Bootstrapping)，程序重復1 000 次，其他參數默認。

1.3 轉錄激活活性驗證

根據已測序的MrERF1cDNA 序列設計含EcoRⅠ位點的正向引物ERF1 (5′-GAATTCGGATCCATG CCATTGCCAATGATGTT-3′)和反向引物ERF2 (5′-GAATTCGAGCTCTCACCCTGAGGGAGAGGAG CT-3′)，擴增MrERF1基因編碼區。擴增的片段測序確認后用EcoR Ⅰ酶切，將酶切后的片段插入到經EcoR Ⅰ酶切后并使用熱敏磷酸酶(NEB，北京)處理的pGBKT7 (BD Biosciences，美國)酵母表達載體內，轉化DH5α 大腸桿菌感受態，挑選陽性克隆提取質粒，酶切鑒定后，獲得重組的酵母表達載體pGBKT7-MrERF1。

通過PEG/LiAc 法[24]將pGBKT7-MrERF1 轉化進入酵母AH109 感受態細胞(Clontech，美國)，同時轉化pGBKT7 空質粒為陰性對照，涂布在SD/-Trp固體培養基中。培養3 d 后挑取單菌落重懸于100 μL滅菌ddH2O 中，分別取2 μL 重懸液點在SD/-Trp 及含X-α-gal (Solarbio，北京)的SD/-His 固體培養基上，根據菌落生長情況及是否變藍來驗證MrERF1的轉錄激活活性。

1.4 亞細胞定位分析

根據已測序的MrERF1cDNA 序列設計含BamHⅠ位點的正向引物MrERF1 (5′-GAATTCGGATCC ATGCCATTGCCAATGATGTTT-3′)和含KpnⅠ位點的反向引物MrERF2 (5′-GAATTCGGTACCTGAG GGAGAGGAGCTATATC-3′)，擴增MrERF1基因編碼區。擴增的片段測序確認后用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切，將酶切后的片段插入到經BamHⅠ/KpnⅠ雙酶切的PBI121-EGFP 載體內，轉化DH5α 大腸桿菌感受態，挑選陽性克隆提取質粒，酶切鑒定后，獲得重組表達載體35S∶∶MrERF1∶EGFP。

將構建好的35S∶∶MrERF1∶EGFP 重組載體及35S∶∶EGFP 陰性對照載體分別轉化農桿菌C58C1感受態細胞。挑選陽性單克隆菌落于含50 μg·mL-1Kan 和25 μg·mL-1Gent 的LB 液體培養基中28 ℃震蕩培養至OD600為0.6。離心收集菌體，用0.5 mol·L-1的2-N-嗎啡乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid,MES) (pH = 5.7)、1 mol·L-1的MgCl2和100 mmol·L-1的乙酰丁香酮(pH = 5.7)配制的溶液重懸菌體使重懸液OD600為0.5。用無針頭注射器吸取重懸液于葉背面注入生長3 周的本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉片內，在黑暗條件下培養3 d 后于熒光顯微鏡下觀察葉片細胞中熒光的分布。

1.5 MrERF1 基因的表達分析

在不同非生物脅迫和ABA 處理下分別用整株扁蓿豆幼苗、幼苗的地上部分和根為樣品分析MrERF1的表達。將材料中所述樣品合成cDNA，稀釋至100 ng·μL-1為模板，用TaqDNA 聚合酶(TaKaRa，大連)進行半定量RT-PCR，反應體系20 μL。擴增反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共計35 個循環；72 ℃延伸10 min。MrERF1基因的上游引物和下游引物分別為MrERF-F (5′-TGAAGAGGGACAAGAACTAT CG-3′)和MrERF-R (5′-AATCATAACGGAAGTAG GGACC-3′)，Actin基因的上游引物和下游引物分別為MrActin-F (5′-TGCTTCTAACTGAGGCTCCAC T-3′)和MrActin-R (5′-AAAGGACTTCTGGGCAA CG-3′)。反應完成后使用濃度為0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 MrERF1 基因的克隆和生物信息學分析

根據已有的扁蓿豆轉錄組測序數據設計引物，采用反轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)方法從低溫處理8 h 的扁蓿豆幼苗中擴增得到約1 200 bp 的特異片段，將其命名為MrERF1(GenBank 登錄號：MW600721)。測序結果顯示該cDNA 長1 225 bp，開放閱讀框為948 bp，編碼316 個氨基酸。MrERF1 的氨基酸序列在NCBI 網站上查詢，發現MrERF1 含有1 個AP2保守結構域(圖1A)，具有ERF 轉錄因子亞家族成員的特性，與蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、大豆(Glycine max)、紅車軸草(Trifolium pratense)、鷹嘴豆(Cicer arietinum)等豆科植物ERF 家族成員高度同源；對MrERF1 的核定位序列預測表明，在78～81位(KRRR)、141～147 位(PKRKYRG)存在核定位信號(圖1A)；用DNAMAN8.0 軟件進行的氨基酸序列比對結果顯示(圖1A)，比對的序列均含有一個AP2保守結構域，其中與蒺藜苜蓿同源蛋白的相似性達91%。采用ProtParam 工具預測MrERF1 蛋白的分子量為35.05 kDa、理論等電點為6.45，其中陰性氨基酸(Asp + Glu) 30 個、陽性氨基酸(Arg + Lys) 28 個，總平均親水性-0.81，屬于親水性蛋白。信號肽預測結果表明，MrERF1 不含信號肽。

用MEGA7.0 對豆科同源ERF 蛋白氨基酸序列構建系統進化樹(圖1B)，表明MrERF1 與蒺藜苜蓿ERF 蛋白的親緣關系最近。在擬南芥網站對MrERF1保守結構域進行序列相似性檢索，用MEGA7.0 對擬南芥同源蛋白的AP2 保守結構域序列構建系統進化樹(圖1C)，表明MrERF1 與擬南芥中AtABR1同源性最高。

圖1 MrERF1 序列分析Figure 1 Sequence analysis of MrERF1

2.2 MrERF1 轉錄激活活性分析

將轉pGBKT7-MrERF1 質粒和pGBKT7 質粒的酵母菌液分別點在SD/-Trp 和含X-α-gal 的SD/-His固體培養基上培養3 d 后，酵母生長情況如圖2 所示。在SD/-Trp 固體培養基上，轉化質粒的兩個酵母均能夠正常生長；在含X-α-gal 的SD/-His 固體培養基上，轉pGBKT7 質粒的酵母不能正常生長，而轉pGBKT7-MrERF1 質粒的酵母能夠正常生長并且變藍。

圖2 MrERF1 轉錄激活活性驗證Figure 2 Validation of MrERF1 transcriptionalactivation activity

2.3 MrERF1 蛋白的亞細胞定位

本氏煙草葉片瞬時表達結果顯示(圖3)，35S 驅動下的增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP) (35S∶∶EGFP)的熒光信號分布于整個葉片細胞中，而MrERF1 與EGFP 的融合蛋白(35S∶∶MrERF1∶EGFP)其熒光信號分布于葉片細胞核上。亞細胞定位結果表明，MrERF1 轉錄因子定位于細胞核。

圖3 MrERF1 的亞細胞定位Figure 3 Subcellular localization of MrERF1

2.4 MrERF1 表達模式分析

2.4.1MrERF1在不同組織中及光周期下的表達

此前轉錄組測序分析發現MrERF1受到低溫誘導表達，為了揭示不同組織中MrERF1的表達情況，以4 ℃處理8 h 的扁蓿豆各組織為樣品進行半定量RT-PCR 分析。結果顯示(圖4A)，MrERF1不在根中表達，在莖、葉、芽和花序中均有表達。由于植株地上部分易受到光刺激，為了探究MrERF1的表達是否受光周期或者生物節律的影響，對室溫下正常生長的扁蓿豆植株地上部分組織進行半定量RT-PCR分析。結果表明(圖4B)，MrERF1的表達不受光周期或生物節律的調節。

圖4 MrERF1 基因在各組織中及光周期下的表達Figure 4 Expression of MrERF1 in various tissues and photoperiod

2.4.2MrERF1在不同非生物脅迫和ABA 處理下的表達

為了進一步探討不同非生物脅迫和ABA 處理對MrERF1表達的影響，對低溫、高鹽、干旱、水淹和ABA 處理以及對照組的整株扁蓿豆幼苗進行半定量RT-PCR 分析。結果顯示(圖5A)，除對照組外MrERF1的表達均受到了誘導，并且其表達均呈現先上調后下調的趨勢；在ABA、水淹、高鹽、干旱和低溫處理后MrERF1受到誘導開始表達的時間分別為0.5、0.5、1、1、8 h。

此外，之前的研究結果表明，在低溫處理下MrERF1不在根中表達，因此對扁蓿豆幼苗進行除低溫外的ABA、高鹽、干旱和水淹處理后，分別以幼苗的根和地上部分為樣品對MrERF1轉錄本檢測發現(圖5B)，不同處理下MrERF1在扁蓿豆幼苗的地上部分表達，不在根中表達。

圖5 MrERF1 基因在不同非生物脅迫和ABA 處理下的表達Figure 5 Transcription response of MrERF1 gene to abiotic stress and ABA treatment

3 討論與結論

本研究從低溫處理8 h 的扁蓿豆中克隆到了MrERF1基因，對其編碼的蛋白序列進行同源比對分析，結果表明其含有一個保守的AP2 結構域，屬于ERF 亞家族。與擬南芥中同源ERF 蛋白的AP2結構域構建系統進化樹表明，MrERF1 與擬南芥中AtABR1 同源性最高。在酵母中的研究結果表明，報告基因HIS和LacZ的轉錄被激活，MrERF1 與擬南芥AtABR1[25]相同且具有轉錄激活活性，而其激活活性序列在N 端或C 端有待進一步研究。亞細胞定位結果表明MrERF1 屬于核定位蛋白，與AtABR1蛋白的亞細胞定位結果一致[26]，具有典型的轉錄因子特性。

MrERF1的組織特異性表達分析結果與AtABR1不同。MrERF1不在根中表達，在莖、葉、芽和花序中均有表達且不受光周期或生物節律的調節；而AtABR1在擬南芥所有器官中均表達，在角果和種子中的表達量非常低[27]。張文慧等[28]對白樺(Betula platyphylla)bERF1/2/3的3 個基因研究表明，在高鹽脅迫下，bERF1基因在根、莖、葉中的表達均呈下調趨勢；bERF2的表達在葉中呈上調趨勢、根中呈下調趨勢而在莖中無明顯變化；bERF3的表達在莖和葉中呈上調趨勢，在根中無明顯變化。這表明，盡管這些基因均屬于ERF 亞家族成員，但在不同植物組織中的表達模式存在差異，在植物生長發育過程中發揮著不同的功能。

擬南芥AtABR1 蛋白最初被Pandey 等[27]報道為ABA 信號通路負調控因子，在擬南芥中AtABR1蛋白是與MrERF1 同源性最高的ERF 蛋白。本研究表明在ABA、脫水、高鹽和低溫處理下，MrERF1的表達均受到了誘導，這與Pandey 等[27]對相同處理下AtABR1表達的研究結果一致，表明MrERF1 蛋白與AtABR1 蛋白可能具有同源功能。最近B?umler等[29]研究表明AtABR1還受到水淹誘導表達。與Pandey 等[27]研究結果不同的是，B?umler 等[29]認為AtABR1不參與ABA 信號轉導并且與干旱脅迫響應無關，而是幼苗從花盆中取出時受到損傷誘導其表達，因此本研究在對扁蓿豆進行處理時使用整株幼苗且輕柔操作避免幼苗受到損傷脅迫，高鹽和ABA處理的幼苗避免受到水淹脅迫。半定量RT-PCR 結果顯示，對照組中MrERF1的表達沒有受到誘導，這表明不同處理下MrERF1的表達沒有受到損傷誘導的影響，因此推測MrERF1基因參與了依賴于ABA 的逆境脅迫信號轉導途徑，這更傾向于Pandey 等[27]的研究結果。水淹是一種復合脅迫，除了會引發低氧脅迫外還可能引起植物營養缺乏、機械脅迫和增加感染風險等[30]。當植物遭受水淹時會迅速積累高水平的植物激素乙烯引發進一步的信號級聯[31]，因此還可對扁蓿豆進行乙烯、茉莉酸甲酯和水楊酸等處理進一步分析MrERF1的表達。

綜上所述，本研究克隆了扁蓿豆ERF 轉錄因子基因MrERF1，開放閱讀框為948bp，編碼316 個氨基酸。MrERF1編碼的蛋白定位于細胞核且具有轉錄激活活性。半定量RT-PCR 結果表明MrERF1的轉錄與光周期和生物節律無關且存在組織特異性表達；MrERF1受到高鹽、干旱、水淹、低溫和脫落酸的誘導表達。盡管MrERF1在扁蓿豆的發育過程中的調控作用仍未知，但可以推測MrERF1在調節扁蓿豆抵抗干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫中行使了一定的功能。本研究為MrERF1轉基因功能驗證奠定了基礎，有助于進一步揭示扁蓿豆非生物脅迫響應的分子機制，對扁蓿豆抗逆種質資源的進一步應用及苜蓿屬牧草的抗逆育種具有重要意義。