“關-開”型近紅外熒光探針用于鐵離子和黑茶抗氧化活性測定

肖 峰

（益陽市生態環境局南縣分局，湖南益陽 413000）

熒光分析是通過對體系中熒光的變化，從而準確測量體系中元素的方法。鐵元素廣泛存在于生命體中，與生命體中的血紅蛋白、血紅素、多種酶的構成相關，通過測量生命體中鐵離子的含量，可以了解生命體的狀態，為生命體的分析和檢測提供依據。鐵離子和生命體中的多種酶結合，構成近紅外熒介導的“關-開”策略，能夠更加準確地測量鐵元素含量，而且具有高度選擇性，操作簡單。

在鐵元素的檢測中，由于Fe3+類花菁染料（CyQ），可以通過鹵素巰基的親核取代和重排反應，與鐵離子發生作用，從而準確測量Fe3+含量。通過近紅外熒光能夠測量Fe3+含量，具體的過程包括三個部分，分別是能夠選擇性的標記或識別基團，發出熒光，并且能夠將信號單元和識別單元相連。相關研究顯示，使用類花菁染料作為熒光團，能夠測量細胞中的Fe3+含量，而且該測量方法具有高度的選擇性和準確性。黑茶的抗氧化活性是衡量黑茶質量的重要標準之一，利用類花箐染料與Fe3+的熒光反應，采用近紅外熒光的方式，能夠準確測量其含量。黑茶中黃酮和兒茶素等含量越高，其抗氧化性越強，利用“關-開”型近紅外熒光探針測量鐵離子含量，能夠分析黑茶中氧化自由基的含量，從而分析其抗氧化活性。

1 材料與方法1.1 儀器與試劑

4-甲基喹啉、碘乙烷、金屬離子的高氯酸鹽。其余化學試劑均為國產市售分析純；實驗用水均為二次蒸餾水。

F-4500熒光分光光度計；UV-3100 紫外-可見分光光度計；Varian INOVA400核磁共振儀；HP1100LC/MSD質譜儀。

1.2 化合物CyQ的制備

將0.432g （2.5mmol）4-甲基-N-乙基喹啉，0.338g （1.0 mmol）N-[（3-（苯胺基亞甲基）-2-氯-1-環己烯-1-基）亞甲基]苯胺鹽酸鹽及0.205g （2.5mmol）無水醋酸鈉溶于15mL乙醇中，在氮氣保護下于80℃反應1h。冷卻后，旋蒸除溶劑，然后在氯仿/醋酸鈉溶液中攪拌1h，過濾，真空干燥，柱層析分離（展開劑為甲醇/二氯甲烷，體積比為1∶19），得棕紅色固體0.286g，產率47.2%。理論計算值，479.22。

1.3 探針CyQ-Cys的制備

化合物CyQ用DMF配成10mol/L溶液，Cys用去離子水配成200mmol/L溶液。在1.5mL離心管中依次加入4.0μL 10mol/L的CyQ溶 液，逐 滴 加 入200mmol/L的Cys溶 液，50μL PBS緩沖液（10mmol/L，pH=7），混合均勻后用DMF稀釋至 500μL （DMF與PBS體積比為9∶1，v/v，10mmol/L，pH=7），反應3min。隨后，用熒光分光光度計記錄熒光信號的變化。在最佳淬滅效果時，獲得探針CyQ-Cys母液。

1.4 光譜檢測

1.4.1 紫外-可見吸收光譜檢測

取上述10.0μL CyQ-Cys母液和100μL PBS緩沖液加入比色皿，均勻混合后用DMF稀釋至1mL，測定CyQ-Cys的紫外-可見吸收光譜。在向比色皿內加入1μL 1mol/L的Fe3+溶液，再測定CyQ-Cys與Fe3+作用后紫外-可見吸收光譜。

1.4.2 熒光發射光譜檢測

取上述5.0μL CyQ-Cys母液液于比色皿，分別加入不同濃度的鐵離子溶液，然后加入50μL PBS緩沖液（0.1mol/L， pH=7），混合均勻后用DMF稀釋至500μL，測激發波長460nm，發射波長660nm處的熒光強度。選擇激發狹縫寬為10.0nm，發射狹縫寬為10.0nm，電壓530V，平行測試3次。

1.5 選擇性實驗與Fe3+檢測

將不同的金屬離子配制成1.0mmol/L的溶液備用，采用CyQ-Cys溶液的溶液500μL作為檢測試劑，在經過3min的反應后，對其熒光信號強度進行分析，測量熒光信號的變化。對不同濃度的鐵離子溶液進行分析，測量該方法下的熒光強度的變化。為了確保測量準確，采用多次測量取平均值的方法，獲得最終的熒光信號強度數值。

1.6 實際樣品的檢測

將連續泡的黑茶于25mL容量瓶中，用硫酸和NaOH溶液調節pH，然后定容。在上述熒光檢測條件下，熒光池中加入500μL上述水樣及CyQ-Cys溶液，測其熒光發射光譜，然后加入不同濃度的Fe3+溶液，用熒光分光光度計記錄熒光信號的變化。平行測試3次。

2 結果與討論

2.1 探針CyQ-Cys的構建及光譜表征

根據生物硫醇和金屬絡合物的反應特性，能夠對鐵離子的測量機理進行分析。研究顯示，將化合物CyQ與Cys結合而構建探針CyQ-Cys的過程中，巰基和鹵素發生作用后，其熒光強度有所減弱。對于該反應而言，當Cys濃度為110μmol/L時，熒光猝滅最為明顯，因此選擇該濃度作為探針濃度。對于鐵離子的紫外-可見光譜的分析而言，近紅外區660nm處的熒光信號顯著增強。因此選擇該波長的光作為測量光譜，構建探針CyQ-Cys。光譜信號的變化說明，探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后展現了熒光的“關-開”過程，有利于Fe3+的熒光檢測。

2.2 pH的影響

對于熒光反應而言，pH對于熒光信號的直接影響并不明顯，但是由于不同pH下的氨基所帶的電荷不同，因此導致Cys分子的活性有所變化，最終影響CyQ與Cys的結合方式，從而改變CyQ-Cys的熒光強度。對于該分析測試而言，需要考慮pH的影響。當處于中性時，探針CyQ-Cys的熒光強度較低 雖然鐵離子能夠增強熒光反應，但是該階段會影響熒光強度的恢復。當在pH為6.0~6.5，鐵離子的加入并不能改變熒光強度的變化，因此該范圍內不適合鐵離子的測量。而當溶液處于弱堿性時，鐵離子會生成氫氧化鐵，最終影響鐵離子的配位，而影響鐵離子的測量結果。對于整個體系而言，Cys等電點為5.5，因此選擇該pH，能夠確保鐵離子與探針具有較強的穩定性，熒光信號變化較小。綜合以上分析可知，選擇662nm處的熒光強度以及中性溶液狀態下，鐵離子能夠與探針發生反應，使其熒光強度發生變化，從而有效地檢測鐵離子含量。

2.3 離子選擇性分析

對探針溶液與不同金屬離子進行分析，測量不同金屬離子的熒光強度的變化。數據顯示，鐵離子與CyQ-Cys作用前后熒光強度的變化。對于CyQ-Cys而言，銅離子、鋅離子、汞離子等常見金屬離子與CyQ-Cys作用后，熒光強度有所減弱，鋁離子和亞鐵離子的熒光增強可以忽略不計。通過研究顯示，鐵離子的加入，使CyQ-Cys溶液的熒光明顯增強，而且當鐵離子與其他金屬離子共存時，也表現出較強的抗干擾能力。數據顯示，探針對于鐵離子具有較高的選擇性，在近紅外區域可以作為鐵離子的檢測探針。

2.4 Fe3+濃度的檢測

采用探針對不同濃度的鐵離子進行分析，通過加入不同濃度的鐵離子，分析不同濃度鐵離子的熒光強度，能夠得到相應的發射光譜。為了確保檢測的準確性，所選擇的溫度為室溫，中性溶液下的熒光強度。對鐵離子的熒光強度分析顯示，在30~60s時，在發射波長660nm處探針CyQ-Cys熒光強度迅速增強，在30s內熒光強度達到最大值，且基本保持恒定。因此選擇660nm波長，室溫以及中性環境下進行鐵離子的熒光測試。通過對40~280μmol/L和280~900μmol/L的鐵離子濃度進行分析，擬合得到其線性回方程分別為Y=0.0034x+0.968 2 （R2=0.995 8）和Y=0.010x+0.922 7 （R2=0.996 8），其最低檢出限為18.2μmol/L。通過該公式，能夠通過熒光強度分析鐵離子濃度。

為了進一步評價鐵離子測量定位準確性，以某河河水作為樣品，分析測量其濃度。根據線性回歸方程，所得到的鐵離子濃度如表1所示。數據顯示，熒光反應法所測得的加標回收率和相對標準偏差符合要求，而且該方法檢測精度高，選擇性高，可以作為鐵離子檢測的方法。

表1 資江河水樣中Fe3+的加標實驗

2.5 黑茶抗氧化活性檢測

準確稱取10g未處理的黑茶（毛茶）和發酵后的安化黑茶（金花黑茶）于100mL沸水中浸泡10min。對茶渣煮沸后濃縮，滴定到50mL的容量瓶中。加入CyQ-Cys溶液與黑茶備用液進入熒光池 分別三次測量其熒光信號的變化，所得到的結果如表2所示。數據顯示，熒光強度越弱則體系抗氧化性越強，通過對比顯示，黑茶的抗氧化性強于毛茶。

表2 毛茶和金花黑茶的還原能力

3 結束語

合成了喹啉基花菁類染料CyQ，利用其與Cys的鹵素-巰基親核取代反應導致CyQ的熒光信號淬滅，構建了一種近紅外熒光探針CyQ-Cys。通過CyQ-Cys與鐵離子的熒光反應，測量其熒光信號的變化，能夠快速檢測鐵離子，而且該方法具有高度選擇性，不受其他金屬離子干擾。采用該種方法可以評估黑茶的抗氧化活性，具有較強的實際應用價值。