超高效液相色譜法測定醬香型白酒高溫大曲中的乳酸含量

趙尚碧，趙振宇，劉 松，曾穩穩，王和玉，王 莉

（貴州茅臺酒股份有限公司，貴州仁懷 564501）

白酒中的有機酸主要有甲酸、乙酸、己酸、丁酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸等數十種，其來源不一，但都是微生物發酵或醇氧化而成[1]。酸類物質是白酒中重要的呈香呈味物質，在白酒微量芳香成分中占很大比例，同時酸類也是形成酯類的前體物質[2-3]。乳酸為揮發性較弱的有機酸，在白酒有機酸中占據著很大的比例，是醬香型白酒發酵過程中一種必不可少的有機酸，適量的乳酸在白酒生產中可以起到抑制雜菌生長、調節酸度的作用，但乳酸含量偏高容易造成淀粉的糖化率降低，出酒率也會降低[4-7]。因此，監測白酒發酵過程中乳酸的含量至關重要。

高溫大曲是醬香型白酒生產過程中重要的糖化劑和發酵劑，也是釀酒原料的一部分，通過自然接種、高溫發酵而制成，是醬香型白酒香氣成分的主要來源之一[8-10]。高溫制曲、用曲量大是生產醬香型白酒的一大特點，乳酸菌是大曲中含有的一種耐高溫的厭氧型或兼性厭氧型細菌，主要代謝產物為乳酸[11-12]。醬香型白酒經過多輪次堆積發酵，大曲的加入會使酒醅的乳酸逐漸積累，從而導致酸度持續增加，酸度增加過度會影響產酒酵母和其他產風味物質微生物的生長代謝，影響酒的產量和質量[13-14]。目前行業中對酒醅中乳酸的檢測已有報道[15-20]，但大曲中的乳酸檢測還未見報道，本文旨在建立一種能夠準確、快速測定醬香型高溫大曲中乳酸含量的方法，為白酒釀造過程中乳酸的監控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

醬香型高溫大曲：某酒廠提供；L-乳酸（色譜純，98 %，Sigma-Aldrich 公司，美國），甲醇（色譜純，TEDIA 公司，美國），磷酸（色譜純，阿拉丁）；實驗室用水均為超純水（18.2 MΩ·cm）。

儀器設備：超高效液相色譜儀帶PDA 檢測器（I-Class，Waters，美國）；ACQUITYUPLC?HSS T3色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm，Waters，美國）；超純水儀（Milli-Q）；多管渦旋振蕩器（Talboys，美國）高速冷凍離心機（MIKRO220R，Hettich，德國）；超聲波清洗器（KQ-500DA 型，昆山市超聲儀器有限公司）；漩渦混合器（Vortex-Genie2T，美國）；電子天平（0.01 g，梅特勒-托利多）；0.22 μm 濾頭（親水性PTFE針式濾器，安譜）。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲樣品處理

大曲樣品粉碎后，稱取5 g 粉末樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 水，渦旋振蕩10 min 后，以6000 r/min的轉速冷凍離心5 min，吸取上清液1 mL于2 mL 離心管中，以12000 r/min 冷凍離心10 min，再吸取一定量的上清液用水稀釋30 倍，最后經0.22 μm微孔濾膜過濾進樣。

1.2.2 色譜條件

流動相：0.12%磷酸溶液作為流動相A，100%甲醇作為流動相B，梯度洗脫；柱溫：45 ℃；流速：0.45 mL/min；進樣量：1 μL；檢測波長：214 nm；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 標準溶液的配制

準確稱取一定量的L-乳酸標準品，用超純水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，得到2000 mg/L 的乳酸標準儲備液，置于4 ℃冰箱保存。取一定量的乳酸標準儲備液進行稀釋，分別配成20 mg/L、

50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L的標準溶液，漩渦混勻。

2 結果與討論

2.1 方法優化

2.1.1 浸提方式的選擇

乳酸易溶于水，并且超純水純度高，不會引入雜質污染，因此選擇超純水作為浸提溶劑。選取1份大曲樣品，稱取5 g 加入10 mL 水，分別采用浸泡、超聲和渦旋振蕩的方式提取10 min，并測定乳酸含量，每種浸提方式做3 次平行實驗，并計算標準偏差，實驗結果見圖1。

圖1 浸提方式的選擇（n=3）

由圖1 可知，3 種浸提方式均能提取出大曲樣品中的乳酸，浸泡和超聲兩種方式的提取效率差不多，渦旋振蕩方式比浸泡和超聲的提取效率高19%左右。因此，選取渦旋振蕩方式進行提取。

2.1.2 色譜柱的選擇

試驗中分別將ZORBXRRHTSB-C18（2.1×50 mm，1.8 μm）和ACQUITYUPLC? HSS T3 色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm）色譜柱進行對比試驗。如圖2 所示，當使用ZORBX RRHT SB-C18色譜柱時，樣品中乳酸峰與雜質峰不能完全分離，而選用ACQUITYUPLC? HSS T3 柱時，能把乳酸峰和雜質峰很好地分離，并且具有良好的靈敏度。

圖2 色譜柱的選擇

2.1.3 進樣量的優化

該研究對色譜條件中的進樣量進行了優化，取一份大曲樣品，按1.2.1 的方法處理后，在其他色譜條件相同的情況下，改變進樣量，結果如圖3 所示。由圖3 可知，當進樣量為10 μL 和5 μL 時，樣品中乳酸峰和它前后的峰不能完全分離，會使定量不準確，當進樣量為1 μL 時，乳酸峰不受其他峰的干擾，分離得很好，所以進樣量確定為1 μL。

圖3 不同進樣量色譜圖

2.2 定性與定量

乳酸標品和大曲樣品檢測分析結果分別見圖4和圖5，由圖4 和圖5 可以看出，大曲樣品中乳酸與乳酸標準品保留時間一致，出峰時間在0.913 min，且分離效果較好，能夠滿足檢測需求。

圖4 乳酸標準品色譜圖

圖5 大曲樣品色譜圖

2.3 標準曲線的建立

乳酸標準曲線見圖6，由圖6 可看出，乳酸標準溶液在20～800 mg/L 范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=1.026X+5.473，R2=0.9997，滿足檢測要求。以信噪比S/N=3 計算出儀器檢出限（LOD）為4.05 μg/kg，以信噪比S/N=10 計算出儀器定量限（LOQ）為13.50 μg/kg。

圖6 乳酸標準曲線

2.4 大曲樣品的測定

2.4.1 精密度分析

取1 份大曲樣品，按1.2.1 的方法處理后平行測定6 次，結果見表2，RSD 值為3.03 %，精密度滿足分析要求。

表2 精密度測定結果

2.4.2 重現性試驗

取同一大曲樣品6 份，按1.2.1 的方法處理后上機檢測，結果見表3。由表3 可看出，6 份相同大曲樣品的RSD 值為0.96%，方法重現性較好。

表3 重現性測定結果

2.4.3 回收率試驗

向已知乳酸濃度的大曲樣品中分別按照5000 mg/L、10000 mg/L 和20000 mg/L 3 個不同添加水平進行乳酸加標回收率實驗，每個添加水平做3 次平行實驗，測定乳酸含量，計算平均回收率，結果見表4。

由表4 可看出，大曲樣品的平均加標回收率在93.4 %～97.2 %之間，表明方法的準確性較好，滿足定量檢測要求。

表4 回收率測定結果

3 結論

采用超高效液相色譜法檢測醬香型高溫大曲中的乳酸含量，乳酸在20～800 mg/L范圍內線性良好，相關系數R2為0.9997，平均加標回收率在93.4 %～97.2%之間，儀器檢出限為4.05 μg/kg，具有較高的精密度和準確度。該方法前處理簡單，分析時間短，滿足定量檢測要求，適用于大曲中乳酸的測定，可為白酒發酵過程的乳酸監測提供一定的參考和技術支持。