醬香型白酒發酵過程中微生物及其酒醅變化分析

崔守瑜，戴奕杰

（1.釣魚臺賓館管理局，北京 100830；2.貴州省產品質量檢驗檢測院，貴州貴陽 550016）

白酒是中國的傳統行業，是世界六大蒸餾酒之一。在不斷發展過程中，根據其制作工藝及風味的不同，可分為清香、濃香、醬香等基本香型。其中，醬香型白酒以其“醬香突出、優雅細膩、柔綿醇厚、回味悠長”的獨特風味，受到廣大消費者的青睞。醬香型白酒的發酵過程獨特而復雜，包括大曲制作、堆積發酵及窖池輪次發酵等[1]，高溫堆積、高溫蒸餾、多輪次發酵、生產周期長、貯存時間長等特點使得醬香型白酒區別于其他香型酒[2]。醬香型白酒在生產過程中，多階段多輪次的微生物發酵是質控的關鍵步驟，因此每個發酵階段酒醅中的微生物動態變化，對后期白酒產量及風味均具有重大貢獻。尤其堆積發酵是大曲制作和酒窖發酵之間的橋梁[3]，開放式的地面堆積發酵能使環境中的微生物參與到整個發酵過程，調整酒醅中微生物群落結構，以促進酒醅中的物質充分分解轉化，還為美拉德反應提供了前提條件。

最近的研究主要集中在酒曲的質控提升、窖泥中微生物群落的特征及酒的風味成分[4-5]，也有研究根據不同香型酒，分別研究清香型、濃香型、醬香型酒發酵時間的不同，比較菌群多樣性與風味的相關性[6-7]。杜艾明[8]調查了清香型白酒釀造核心功能微生物，主要是乳酸菌、醋酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌及少數霉菌，這些菌群的更新變化與酒中的風味成分具有直接關系。高江婧[9]研究了濃香型白酒酒醅中風味物質與微生物群結構隨發酵時間的變化規律，發現窖池底泥為酒醅提供了梭菌科和瘤胃菌科等厭氧微生物，這些微生物促進發酵后期己酸、丁酸、乙酸的合成，對濃香型白酒的風味具有重大貢獻。高溫堆積發酵作為醬香型白酒的特征工藝，是大曲釀造和窖池發酵的緊密連接，在堆積發酵過程中物料和微生物發生的變化規律也是眾多學者所一直關注的熱點問題。

本研究以醬香型白酒為研究對象，研究了在下沙、糙沙輪次堆積發酵中，酒醅堆積溫度及pH 值與微生物群動態變化的相關性，為揭示醬香型白酒生產微生物變化及風味形成機制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：下沙、糙沙及7 個輪次起窖、下窖過程中的酒醅；化學試劑及培養基均為國藥分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集

選取從下沙階段到7 輪次高溫堆積樣品，及酒醅下窖于窖池發酵的樣品。根據等距采樣法，分別在酒醅上、中、下層等距采集3 個位點的樣本。樣本采集后混合均勻，并分裝于無菌袋封裝標記，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 微生物的分離及計數

根據國標GB 4789.2—2016 方法處理樣品。取25 g 不同加工階段的酒醅樣品，于裝有225 mL 無菌生理鹽水（含6 粒玻璃珠）的錐形瓶中，置于搖床中振蕩5 min，使樣品液充分均勻。吸取1 mL樣品液于9 mL 無菌生理鹽水中，混合均勻后，重復這一步，進行梯度稀釋，并吸取100 μL 2～3 個適宜稀釋梯度的樣品液于不同微生物培養基中，對霉菌、酵母菌、乳酸菌、芽孢菌及菌落總數進行計數。

1.2.3 pH值的測定

根據文獻方法[10]，取5 g 酒醅，加入45 mL 蒸餾水，置于漩渦振蕩器上混合均勻。靜置5 min，取上清液測定pH值。

1.2.4 溫度的測定

采用探針溫度計對不同發酵時期的酒醅堆進行溫度測量，待溫度計數值穩定后記錄數據。

2 結果與分析

2.1 下沙、糙沙輪次堆積發酵酒醅的微生物變化

通過倍比稀釋平板培養計數法發現，酒醅在不同發酵階段微生物菌群呈動態變化。由表1 可知，發酵初期（下沙堆積）菌群得以快速增殖，菌落總數高達9.7×108CFU/g，主要為酵母菌、乳酸菌，但芽孢桿菌和霉菌仍占一定比例。在糙沙起窖階段，可能是新物料加入，使得原有的微生物菌落數相對減少，但隨著堆積發酵，微生物又利用新的物料進行生長代謝，因此各菌群在堆積過程中均有增殖現象。

窖池發酵可以再次富集培養環境中的微生物，在一輪次至三輪次的窖池發酵中，主要功能優勢菌是酵母菌屬，數量可達到106～107CFU/g，其次是霉菌屬，數量在105～107CFU/g。酵母菌是參與發酵產酒產香的重要微生物，但酵母菌在高溫環境下無法生存。酵母菌的帶入可能是因為開放式的生產環境使得環境中的酵母菌散落在酒醅表面并在堆積發酵中生長繁殖，之前也有研究證明，酵母菌在酒醅中的豐度是上層高于中、下層[11]。因此在一輪次起窖階段，酵母菌菌落數遠低于堆積發酵時期。但在下窖期，酵母菌有增殖趨勢，結合溫度檢測結果，可能是第一次下窖，窖池溫度較低，適合于酵母菌的大量繁殖。但隨著酒醅在窖池中繼續發酵，微生物繁殖釋放出大量熱量，酵母菌無法存活在高溫環境中，酵母菌在整個釀造過程中活菌數呈現出波浪型的變化規律。

霉菌的主要功能是分泌糖化酶、液化酶及蛋白酶，有助于分解釀酒原料中的淀粉、蛋白質等大分子物質，有促進風味物質形成的作用[12]。由表1 可知，霉菌在堆積階段是呈上升趨勢的，最大值可達1.2×107CFU/g，但下窖池發酵后，可能是因為高溫、水分含量少、缺氧導致霉菌最終下降至400 CFU/g。霉菌與酵母菌的變化規律類似，也是呈動態波動的。據報道，霉菌能產生豐富的酯化酶系，所產生的酶能將酸與醇縮合成酯，同時，多種霉菌共同發酵，釋放出含硫香味物質的前體，轉化為含硫的雜環香味物質，形成特有的醬香味[13]。王曉丹[14]從醬香型大曲中分離得到1 株散囊菌——阿姆斯特丹散囊菌，該菌能產生L-芳樟醇、2-庚酮等花果香味，這對醬香型白酒的風味具有一定貢獻。

細菌是廣泛存在于整個制作工藝中的，因此通過高溫發酵后所生存下來的細菌主要是嗜熱菌，以芽孢桿菌屬、乳酸菌屬為主。在下沙堆積階段，酒醅中乳酸菌含量很高，高達108數量級，而在發酵中期，回落到104數量級，后期可能窖泥中的厭氧菌摻入酒醅中迅速增殖，而在氧氣充分時，部分死亡，發酵末期有回升的現象。芽孢桿菌作為高溫大曲中重要功能菌組成成分，在整個發酵期間較穩定，堆積初期最高可達5.2×106CFU/g，但在整個發酵期基本保持在104CFU/g的豐度，發酵末期又回升到106CFU/g，符合菌群動態變化規律。

2.2 下沙、糙沙輪次堆積發酵過程中酒醅的溫度變化情況（圖1）

圖1 不同發酵時期，酒醅溫度的變化

在堆積發酵過程中，復雜的微生物群會分解淀粉、蛋白質等釋放出大量熱量，探究堆積發酵過程的溫度變化有助于間接了解微生物的代謝情況。下沙、糙沙堆積從起堆到堆積完成大概需要3 d，因此我們檢測了堆積24 h、48 h、72 h酒醅溫度變化情況。由圖1 可看出，不管是下沙還是糙沙堆積階段，酒醅溫度均隨發酵時間的延長而升高，且在24～48 h 溫度上升很快，在72 h 時達到最高，溫度達41～51.8 ℃。而酒醅在一輪次下窖后，前3 天的溫度變化情況較緩慢，但仍呈上升趨勢。二輪次下窖后的酒醅溫度變化同樣較緩慢，屬于延遲期。在經過前期幾輪反復的起窖發酵和下窖發酵后，從三輪次下窖開始，酒醅在酒窖中發酵溫度上升很快，且溫度高達60 ℃。各階段的發酵溫度均與發酵時間直接相關，隨發酵時間的延長而溫度上升。

綜合以上現象分析，各發酵階段酒醅變化隨發酵時間呈現直線型變化，且整體發酵過程成“V”型曲線，這可能與不同時期其優勢功能微生物菌屬的生長代謝有關聯，而在后期發酵更利于嗜熱性微生物生長代謝釋放出大量的熱量。

2.3 下沙、糙沙輪次堆積發酵過程中酒醅的pH 值變化情況（圖2）

圖2 不同發酵時期，酒醅pH值的變化

由圖2 所知，在發酵初期，酒醅的pH 值由4.4下降到3.7，這可能是酵母菌的迅速繁殖，產生了大量的CO2，使得酒醅pH 值迅速下降。然而在堆積發酵中，由于霉菌、酵母菌、乳酸菌及芽孢桿菌均在大量繁殖，代謝產物中和了氫離子的濃度，使得pH值又回調到了4.4 左右。而在下窖到窖池發酵階段，酒醅pH 值變化較小，基本穩定在3.5 左右，說明pH 3.5 左右時對產酸菌的生長有抑制作用，也可能是由于酒醅中的氧氣被消耗掉，進入厭氧發酵，使得酵母從有氧代謝轉化為無氧代謝，產生大量酒精。環境中的厭氧菌和酒醅中的兼性厭氧菌得以增殖，代謝產生有機酸，大部分有機酸為弱酸，對pH值影響不顯著。

3 小結

通過醬香型白酒酒醅的不同生產加工階段，研究了酒醅中主要的優勢微生物菌群及溫度、pH 值的變化，發現在整個發酵生產過程中，菌落總數呈現出一個動態的“V”型變化規律。前期主要以酵母菌屬、乳酸菌屬發酵產熱產酸，中期芽孢桿菌生長較穩定，由于窖池厭氧發酵，酒醅堆積溶氧量不夠，升溫較緩慢。后期因釀造原料被充分分解，形成了較大的細孔，且pH 值下降到了3.5 抑制了霉菌及酵母菌的生長，但厭氧性芽孢桿菌得到大量繁殖，釋放出大量熱量。每個發酵階段的優勢功能菌根據發酵環境及條件的變化進行更替，以充分利用釀造原料中的營養物質進行代謝分解，釋放出各種生物酶，代謝產生具有香味或風味的代謝產物，為提升酒產量及酒質做出了一定貢獻。