青稞酒大曲微生物的分離鑒定及可培養微生物變化規律分析

陳占秀，喇錄忠，黃和強，車富紅，祁萬軍，孔令武，李善文

（青海互助青稞酒股份有限公司，青海 互助 810500）

酒曲中含有多種微生物及其產生的復雜酶系，是中國白酒釀造必不可少的糖化劑、發酵劑和生香劑[1]，由于大曲中微生物種類和數量關系的不同，在白酒生產發酵過程中的代謝產物也不同，加上地域、氣候、環境等條件上的差異，各白酒生產企業所用大曲中微生物種類及數量存在較大差異，因而形成了風格風味迥異的白酒產品[2]。由于大曲中微生物的多樣性，在大曲培養過程中有霉菌、細菌、酵母菌、放線菌等微生物，豐富的菌系影響著大曲的質量，并進一步影響白酒品質。

青稞香型大曲白酒采用傳統工藝制成的“白霜滿天星”和“槐瓤曲”作為糖化發酵劑，精選青稞和豌豆以一定比例混合制曲，更適合釀酒微生物對營養的需求，為微生物的生長繁殖創造了良好的條件，獨特的制曲原料和工藝也造就了獨特的產品風格。青稞酒大曲制作和貯存過程中，微生物隨著時間的變化，呈不同的變化趨勢，通過研究青稞酒大曲培養過程中微生物數量變化規律，可為分析白酒風格風味提供重要理論依據。目前，對大曲中微生物的研究主要分為表型特征鑒定法和基因型鑒定法。表型特征鑒定法是與微生物分離相結合的，這種方法工作量大，準確率低，但是能得到活的菌株，利于后續研究[6]。如Wang 等[16]通過表型特征鑒定法對茅臺大曲中的微生物進行了系統的分離鑒定。基因型鑒定法多是對樣品進行總DNA 的提取之后，通過對微生物通用保守序列的比對，從而可以分析鑒定出樣品中可培養以及不可培養的微生物，具有快速準確等優點，但是多數得不到活的菌株，不利于后續深入研究。本文結合兩種方法，研究了大曲培養過程中細菌、酵母菌、霉菌及菌落總數的變化規律，并對青稞酒制曲和儲存期的微生物進行分離和鑒定，為進一步研究青稞酒大曲微生物奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：青稞酒制曲期和儲存期大曲，其中對生產過程中0、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、8 d、12 d、15 d、21 d 和26 d（出房）樣品進行采集。大曲貯存期樣品：同批大曲入庫后每7 d 取樣1 次，跟蹤取樣6 個月。每次4 塊大曲，粉碎混合后為1 個樣品。在形態學觀察的基礎上，挑取了22 株細菌進行16S rDNA 序列測序與比對，50 株真菌進行ITS1/ITS2 測序比對。

試劑：無水葡萄糖、蛋白胨、瓊脂粉、營養瓊脂、孟加拉紅瓊脂培養基、MRS、冰乙酸，國藥（集團）上海化學試劑有限公司；營養瓊脂培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司；真菌基因組快速提取試劑盒、細菌基因組快速提取試劑盒、酵母提取物、引物27f、1492r、Tris、Taq DNA 聚合酶、DNA 分子量標準Marker、dNTP Mixture,10mM、4S Green 核酸染色劑、EDTA 溶液,pH 8.0、瓊脂糖，生工生物工程股份有限公司。

儀器設備：潔凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；HYG-B 全溫搖瓶柜，蘇州培英實驗設備有限公司；恒溫恒濕培養箱，泰斯特儀器有限公司；高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；厭氧工作站、高速冷凍離心機、梯度PCR 儀、蛋白核酸測定分光光度計，美國賽默飛科技公司；凝膠成像系統、電泳儀，北京六一等。

1.2 實驗方法

操作流程：取樣→粉碎混合→菌懸液→傾倒平皿→稀釋涂布平板→培養→平板計數→計算菌落總數→菌種分離純化→核酸的提取和PCR 擴增測序。

1.2.1 可培養微生物檢測與菌種分離純化[3]

樣品預處理：稱取5 g 大曲樣品，放入100 mL滅菌后的0.9%生理鹽水中，30 ℃搖床200 r/min 振蕩10 min。

可培養微生物檢測：吸取振蕩后的菌懸液100 μL，用0.9%的生理鹽水稀釋到10-1～10-5等不同梯度，分別吸取100 μL 稀釋后的各菌懸液在不同培養基上進行涂布培養，培養條件：濕度60%，真菌培養基溫度為30 ℃，細菌培養基溫度為37 ℃，培養48～72 h，厭氧培養操作在厭氧工作站進行，菌落計數以出現30～300 CFU 細菌和酵母菌菌落數的稀釋度的平板為計數標準，絲狀真菌為10～150 CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數[7]。觀察記錄菌落信息，挑取平板上形態特征不同的單菌落，通過劃線純化，并接種于斜面（4 ℃）保藏和甘油冷凍（-80 ℃）保藏。

1.2.2 核酸提取方法[4]

分離純化的菌株分別進行液態培養，酵母菌用YPD 液態培養基、細菌用LB 培養基、厭氧菌用PYG 液態培養基，取2 mL 菌液,加入滅菌后的離心管中，12000 r/min 下以4 ℃、2 min 離心棄上清液收集菌體，用基因組快速提取試劑盒進行核酸提取；質量檢測：向離心管中加入30 μL 超純水，溶解核酸；用核酸濃度儀測定核酸濃度和A260/A280 值（1.8～2.0）。

1.2.3 PCR擴增及瓊脂糖電泳檢測

對所提取的細菌基因組DNA 進行16S rRNA基因片段擴增，采用細菌16S rRNA 基因的通用引物：正向引物F27（AGAGTTTGATCCTGGCTCA），反向引物R1492（GGTTACCTTGTTACGACTT）；真菌基因片段擴增選擇通用引物：NL1（GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG）NL4（GGTCCGTGTTTCAAGACGG）；PCR 采用50 μL 體系，擴增反應條件如表1，反應完成后，取3 μL PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR擴增片段。

12月4日，上海證券交易所官網公布了一份《西安高新控股有限公司關于修訂公司章程及董事長、董事、總經理發生變動的公告》，披露了該公司高層變動的信息。

表1 PCR擴增反應程序

2 結果與分析

2.1 大曲微生物的分離和純化

將分離到的菌株菌落，通過多次劃線純化挑取，并接種于平板培養基中。經過菌落形態特征排重，從青稞酒大曲中總共分離到37 株酵母菌，13 株霉菌及22株細菌。

2.2 青稞酒大曲微生物的鑒定

2.2.1 青稞酒大曲細菌的鑒定

在對分離的22 株細菌的16S rRNA 基因區序列進行了PCR 擴增并測序，并將細菌的16S rRNA基因區序列在GenBank 數據庫中進行同源序列搜索(BLAST)后，將相似度大于99 %鑒定為同一種，98 %～99 %的鑒定為同一屬，小于98 %的初步鑒定為新種[6]。對15株細菌進行了鑒定，其中有12株細菌鑒定到種，分屬于Staphylococcus succinus，Bacillus atrophaeus，Staphylococcus xylosus，Alcaligenes faecalis，Bacillus subtilis，Klebsiella oxytoca，Pantoea agglomerans，Bacterium strain，Staphylococcus vitulinus，Staphylococcus sciuri，Ochrobactrum pseudintermedium11 個種，2 株鑒定到屬，為Bacillus sp、Oceanobacillus sp，另外1 株為Cellulosimicrobium funkei。

2.2.2 青稞酒大曲酵母菌的鑒定

選用通用引物，對分離的37株酵母菌的ITS 基因區序列進行了PCR 擴增并測序，用NCBI Blast 程序將拼接后的37 株酵母菌序列文件與NCBI 核酸數據庫中的數據進行比對，得到與待測物種序列相似性最大的物種信息，通過比對，相似度大于99%的有10 株共4 種，為Saccharomyces cerevisiae、Meyerozyma guilliermondii、Trichosporon asahii、Wicker-hamomyces anomalus，其余25 株鑒定到屬，分屬于Millerozyma farinosa，Hyphopichia burtonii，Candida fermentati，Saccharomycopsis fibuligera，Pichia fermentans，Issatchenkia orientalis，Cutaneotrichosporon mucoides，Pichia guilliermondii，Exophiala dermatitidis，Kazachstania unispora，Candida anglica，另外有2 株比對后的相似度只有97 %，初步認為是新種。

2.2.3 青稞酒大曲霉菌的鑒定

選用通用引物，對分離的13株霉菌的ITS 基因區序列進行了PCR 擴增并測序，并將13 株霉菌序列文件與NCBI 核酸數據庫中的數據進行比對，1株鑒定到種，為Penicillium granulatum，其余10 株鑒定到屬，分屬于Penicillium griseofulvum，Aspergillus flavus，Fusarium oxysporum，Aspergillus fumigatus，Aspergillus oryzae，Circinella muscae，Lichtheimia corymbifera，Rhizopus，另外兩株相似度為97%，初步認為是新種。

2.3 青稞酒大曲制曲期微生物消長規律

青稞酒大曲中細菌數量最高，其次為酵母菌，霉菌數量最少，如圖1 所示。微生物數量前期變化較大，曲心溫度最高時，細菌和酵母菌數量略有降低，除此之外，整體微生物數量呈上升趨勢，5 d左右達到最高后基本趨于穩定，出房時細菌略有下降。

圖1 青稞酒大曲制曲期微生物數量變化規律

2.3.1 細菌數量消長規律（圖2）

圖2 青稞酒大曲制曲期細菌數量變化規律

由圖2 所示，在一個培養周期內，由于大曲培養方式的開放性，各曲房曲存在一定差異，細菌數量也存在一定差異，總體規律表明，細菌數量在培養初期快速增加，4～5 d 達到最大值，后期基本保持平衡，培養結束時略有下降，以均值計，細菌總數為5.5×108個/g 曲坯，細菌中Pantoea和Staphylococcus占有很高的優勢，從培養2 d 至培養結束，Pantoea比例為細菌總數的50 %～65 %，Staphylococcus為10%～25%。

2.3.2 酵母數量消長規律（圖3）

圖3 青稞酒大曲制曲期酵母菌數量變化規律

因各曲房制曲存在一定差異，酵母菌數量也存在一定差異，尤其酵母菌受溫度和水分影響大，因此酵母菌差異較大，如圖3 所示，隨著曲房溫度升高，酵母菌在2～5 d內快速增長，后隨著曲房降溫，酵母菌數量略有降低，在10～15 d 又有增加并達到最大值，后期基本保持平衡。以均值計，酵母菌總數為3.6×107個/g 曲坯，從第3 天開始一直到出房，Saccharomycopsis占有很高的優勢，從2 d時的20%到5 d 時快速增加到70%～80%，到培養結束時仍占酵母菌總數的80%，同時Pichia、Wickerhamomyces也有一定的優勢性。

2.3.3 霉菌數量消長規律（圖4）

圖4 青稞酒大曲制曲期霉菌數量變化規律

由于大曲培養方式的開放性，各曲房曲存在一定差異，如圖4 所示，總體規律表明，霉菌數量在培養過程中先基本不變，5 d 后開始大量繁殖，15 d 左右數量達到最高，后期略有降低。這主要由于前期升溫快不利于霉菌繁殖，細菌和酵母菌數量急速增加，后期溫度上升減緩，大曲水分適宜霉菌生長繁殖，培養到15 d 時大曲水分已降到15%以下，不利于霉菌的生長，霉菌數量略微下降，以均值計，霉菌總數為8.5×106個/g 曲坯，主要優勢菌為根毛霉屬(Rhizomucor）。

2.4 青稞酒大曲貯存期微生物消長規律

青稞酒大曲在培養結束后，經過水分、酸度、糖化力、液化力等理化指標檢測，以及曲香、表面掛霉程度、斷面齊整度、菌絲情況、曲皮等感官指標檢驗，符合成曲要求的按不同等級貯存3 個月以上再進行釀酒實驗，貯存環境要求低溫干燥。隨著貯存時間延長，微生物多樣性也在發生變化，杜海等[11]通過對不同貯存時期大曲的微生物群落結構的分析，發現3 種大曲相對豐度靠前的優勢菌屬主要為乳酸菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、鏈霉菌屬、短桿菌屬等。隨著貯存時間的延長，3種大曲的物種多樣性都處于上升趨勢。

對青稞酒大曲貯存期微生物進行了可培養檢測，由圖5 可看出，大曲儲存期內霉菌數量持續降低，細菌略多于酵母菌，在儲存后期緩慢降低，酵母菌保持穩定，因酵母菌中優勢菌為Saccharomycopsis fibuligera，青稞酒釀造車間、大曲車間、曲庫的環境中大量存在該菌種；霉菌方面貯存第一個月Lichtheimia corymbifera比例占5 %～10 %，后期緩慢減少；細菌可培養優勢菌貯存前期為Oceanobacillus sp，Pantoe，Staphylococcus等，占細菌總數60%左右，后期減少到20%～25%。

圖5 青稞酒大曲貯存期微生物數量變化規律

3 結論

大曲中細菌、霉菌和酵母菌三者數量占據絕對優勢，青稞酒大曲也不例外。本研究利用傳統分離方法結合PCR 測序技術，從三大類微生物方面入手，系統分析了青稞酒大曲微生物的群落組成及多樣性。結果表明，大曲培養期中細菌數量最多，第0～5 d 是大曲的培菌期，這個時期微生物大量增長，導致溫度不斷上升，環境越來越不適宜微生物的繁殖，3 d 后酵母菌中適宜表面生長的菌種Saccharomycopsis快速增加到70 %～80 %，到培養結束時仍占酵母菌總數的80%，同時Wickerhamomyces也有一定的優勢。在整個大曲培養過程中Pantoea（泛菌屬）占到絕對的優勢，從2 d 開始增加到50 %，培養結束時達到70 %，Staphylococcus（葡萄球菌屬）也具有很高的優勢。

本次通過純培養方法分離青稞酒大曲微生物，分離到22 株細菌，37 株酵母菌，13 株霉菌。通過分子生物學鑒定，其中有15 株細菌主要為球菌屬(Staphylococcus)4 株，桿菌屬(Bacillus)3 株，產堿菌屬（Alcaligenes）2 株，克雷伯氏菌屬（Klebsiella）2株，泛菌屬（Pantoea）1 株，海洋桿菌屬（Oceanobacillus）1 株；霉菌主要有青霉屬（Penicillium）2 株，曲酶屬（Aspergillus）3 株，鐮刀菌屬(Fusarium)1 株，卷霉屬(Circinella)1 株，橫梗霉屬(Lichtheimia)1 株，毛霉屬（Mucor）1 株，根毛霉屬(Rhizomucor)1 株，根霉屬（Rhizopus）1 株；37 株酵母菌有異常維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）7 株，季也蒙酵母屬（Meyerozyma）1 株，假絲酵母屬（Candida）2 株，有孢圓酵母屬（Torulaspora）1 株，畢赤酵母屬（Pichia）5 株，粉酵母屬（Millerozyma）3 株，絲孢畢赤氏酵母屬(Hyphopichia)4 株，伊薩酵母屬（Issatchenkia）3 株，釀酒酵母屬（Saccharomyces）5 株，覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）1 株，以及4 株Exophiala dermatitidis，1株Kazachstania unispora。

因技術方法的限制，以往對大曲微生物群落多樣性的認識僅依賴于傳統的形態特征、生理生化特性的分類和鑒定[10]。高通量測序的應用可一次性對106～108數量級的DNA分子進行序列測定，目前在食品發酵領域被廣泛采用[14]。喬曉梅等[15]擴增清香大曲真菌18S V4 區和ITS 區后，對擴增產物進行高通量測序，發現米根霉Rhizopusoryzae、傘枝犁頭霉Lichtheimia corymbifera、庫德畢赤酵母Pichia kudriavzevii和庫德畢赤酵母Saccharomycopsisfibuligera等為優勢種群[13]。青稞酒大曲也利用高通量測序解析了大曲中微生物群落結構和組分，統計發現，真菌群落中從第3天開始一直到出房，Saccharomycopsis占有很高的優勢，同時Pichia、Wickerhamomyces也有一定的優勢性。整個過程中Pantoea（泛菌屬）占到絕對的優勢，Staphylococcus也具有很高的優勢，初步判定青稞酒大曲中優勢菌：細菌為Pantoea、Staphylococcus，真菌包括Pichia、Saccharomycopsis，除此之外青稞酒大曲中還有Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、Aureobasidium、Acinetobacter、Olivibacter等（數據未發表），與可培養微生物規律和優勢菌種結論基本一致。

大曲本身作為一種選擇性培養基質，對各類釀造環境微生物進行富集篩選，形成了獨特的大曲菌群結構，隨著現代分子生物學技術的發展，菌種分析手段正向著新老技術聯用的方向快速發展，在彌補方法缺陷的同時，拓展大曲微生物的研究范圍[12]。在青稞酒釀酒微生物研究中結合新老技術，如用高通量測序等方法對青稞酒不同季節大曲中的菌群結構及多樣性進行更為全面、實時、精確的分析，并結合代謝組、蛋白組等的研究，分析青稞酒大曲中不同功能菌對制曲和釀酒的影響，結合傳統微生物分離技術，篩選更多青稞酒釀造微生物，為今后功能菌的篩選及強化大曲提供科學依據。