耐高溫工業釀酒酵母的篩選和發酵性能研究

張金偉，王小艷，張 穎，劉 輝，何太波，趙國淼，王澤興，李 凡

（1.延安大學生命科學學院，陜西延安 716000；2.中糧營養健康研究院有限公司，北京 102209；3.中糧生化能源（肇東）有限公司，黑龍江哈爾濱 133010；4.河北環境工程學院，河北秦皇島 066102）

液體燃料乙醇指以生物質為原料通過生物發酵等途徑獲得的可作為燃料用的乙醇，是近年來極為環保的可再生能源之一。隨著我國“十四五”規劃的提出，實現碳達峰、碳中和等目標也提上日程，液體燃料乙醇的開發和利用得到了更多的重視與研究[1-3]。釀酒酵母作為生產燃料乙醇最主要的發酵微生物，已形成了成熟的工業發酵技術體系，但在實際發酵過程中，乙醇產量和糖利用率很難達到理論水平，究其原因是由于工業發酵中的多重脅迫因素造成了酵母細胞的受損和生產性能下降，如發酵過程中溫度升高造成的熱脅迫，發酵底物造成的高糖滲透壓，乙醇積累產生的細胞毒性等[4-5]。其中為控制發酵溫度需要使用大量的冷卻水，尤其在亞熱帶地區，過高的環境溫度會極大地增加冷卻水用量，增加發酵成本；此外不同的發酵原料帶來的滲透壓也有很大差異；實際工業發酵中，在保證乙醇產量不受影響的基礎上，發酵溫度每增加1 ℃都能節省大量的冷卻水使用，因此對逆境耐受能力強的菌株能很大程度上降低發酵成本，產生可觀的經濟效益。

基因組的突變產生豐富的表型以適應環境的變化，這使得基因組具有極強的可塑性，為菌株的選育提供了基礎[6-9]。釀酒酵母的菌株改造有很多方法，基于理性的基因組改造策略，如Luo 等[10]開發了一種能進行酵母染色體大量重排，誘導產生大的基因型多樣性菌株的系統—ReSCuES，利用LoxP 序列的特異性重組結合營養缺陷型篩選得到環境脅迫條件下的耐受菌株。Mitsui 等[11]利用CRISPR/Cas9 編輯系統對轉座子進行隨機突變，成功地得到可以在39 ℃、低pH 值和高乙醇濃度下良好生長的耐熱突變菌株T8-292。此外非理性策略如典型的實驗室的適應性進化，通過緩慢改變外界環境模擬自然選擇過程使得菌種自發突變朝著更適合生長的方向進行[12-13]。通過適應性進化的方法，Pereira 等[13]得到對3 種二元酸（戊二酸，己二酸和海松酸）有較強耐受性的釀酒酵母，Fletcher 等[14]提高了對有機酸和無機酸的耐受性。菌種的適應性進化被視為逆代謝工程的一種方法，通過積累有效的生物表型后再分析相應的分子基礎也是工業微生物改造上的常見理念[2]。為了在短時間內通過實驗室適應性進化獲得耐受菌株，本實驗通過基因組改造縮短了菌株實驗室適應性進化所需時間，篩選獲得了耐受能力較強的菌株，并對其發酵性能進行了評估。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

菌株：釀酒酵母為安琪公司的安琪超酒酵母，其最適生長溫度為32 ℃。

主要試劑：酵母粉，Oxoid 公司；蛋白胨，Oxoid公司；氯化鈉，北京化工廠；瓊脂，Amresco 公司；瓊脂糖，西班牙（上海分裝）；冰醋酸，北京化工廠；山梨醇，Amresco公司；Tris，Sigma公司。

YPD固體培養基：用于釀酒酵母和畢赤酵母的活化、培養及菌種保存，含有1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，2 %葡萄糖，15 %瓊脂，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 基因組的改造

1.2.1 酵母的電擊轉化

取2 μg 左右基因片段或質粒輕輕加入一管感受態細胞中，注意加入體系不應超過感受態細胞體積的1/10。將加入轉化片段或質粒的感受態細胞轉入2 mm 預冷電轉杯中，以1.5 kV，200 W，25 μF的條件電擊5 ms。立即加入1 mL 無抗YPD 培養基，以30 ℃、170 r/min 搖床復蘇1 h。取復蘇后菌體以5000 r/min 離心5 min，棄去上清液，然后用500 μL 1 M 山梨醇重懸菌體，取1/10 涂布于YPD選擇平板上，剩余接入含相應抗性的5 mL YPD 液體培養基中。于30 ℃恒溫培養箱中培養2～3 d，平板進行轉化子篩選。

1.2.2 基因組改造

基于重疊延伸PCR 技術[15]，采用具有互補末端的引物RAD52-F&RAD52-MID-R 與RAD52-MID-F&RAD52-R，擴增獲得L-Arm 與R-Arm 后將兩條片段進行重組，將重組后的片段轉化入釀酒酵母內，通過同源重組敲除RAD52 基因核心區域約890 bp達到酵母基因組的改造目的。

1.3 實驗室的適應性進化與篩選

圖1 RAD52基因的敲除

取原始工業菌株接種到YPD 液體培養基中于32 ℃下活化培養，不間斷取樣，測定其OD600nm處吸光值，待OD 值為10 左右，以10%的轉接量轉接至30%葡萄糖、2%乙醇、32 ℃下培養，期間不間斷取樣測定OD600nm處吸光值，OD 值為10 左右后完成一輪的適應性進化。第二輪以2 %轉接量轉至30 %葡萄糖、4%乙醇、34 ℃下培養，OD 值生長至10 左右再進行下一輪是適應性傳代培養，每一輪依次增加2%的乙醇脅迫與2 ℃的溫度，直至在30%葡萄糖、8%乙醇、40 ℃下生長至10 OD 后，取菌懸液涂布于30 %葡萄糖、8 %乙醇的YPD 固體平板于40 ℃生化培養箱中培養2～3 d。挑取較大的單菌落于32 ℃活化后接種液化醪，35 ℃搖瓶發酵驗證其發酵性能。

1.4 發酵驗證

取工業用液化醪，對篩選出的釀酒酵母進一步調整溫度進行工業物料小試驗證。工藝條件：工業用液化醪為底物，S.C D12 與對照菌株均接種于種子培養基（YPD 液體培養基）中，培養種子液至10 OD 左右，按0.125 億/mL 液化醪計算用量，離心、水洗1 次，用生理鹽水懸浮至2 mL，在1 L 搖瓶中加入350 g 液化醪中。發酵過程測試菌株試驗組均進行溫度調整（0～16 h、32 ℃，17 h、33 ℃，18 h、34 ℃，19～72 h、35 ℃），并加入對照菌株的空白試驗組（不調整溫度，一直控溫32 ℃）進行對照。

2 結果與討論

2.1 酵母菌生長曲線的測定

在進行實驗室的適應性進化前，需要選擇一個合適的轉接和培養時間，一般來說菌株在對數生長的中后期具有較高的代謝活性并易于突變[16]。因此測定了菌株在30 %葡萄糖的YPD 中的生長曲線，如圖2 所示在高糖濃度的YPD 中，菌株最高OD600可至20 左右，OD600為10 時正處于其對數生長中后期，因此選擇OD600值在10左右時作為轉接點，進行多輪的適應性進化。

圖2 出發菌株的生長曲線

2.2 基因組改造

基因組的改造是縮短實驗室進化過程的基礎，只有底盤宿主具有較高的突變率才能在脅迫環境下更快的發生突變產生有義突變表型。有研究表明，釀酒酵母RAD52 基因的缺失能導致宿主具有較高的突變能力[17]，因此通過同源重組敲除宿主RAD52 基因后保證其具有較高的突變能力，能縮短實驗室的適應性進化時間并篩選所需的多重抗逆工業酵母，RAD52 核心區域敲除后其結構如圖3。

圖3 RAD52基因改造后圖譜

2.3 搖瓶驗證（圖4）

對篩選獲得的5 株優勢菌進行液化醪搖瓶發酵驗證，使用肇東工廠生產線上的三期液化醪搖瓶發酵驗證，35 ℃搖瓶發酵66 h，搖瓶發酵結果見圖4，結果顯示S.C D12 乙醇產量顯著高于對照菌株，葡萄糖殘留顯著優于對照菌株。

圖4 發酵成熟醪殘葡萄糖含量和乙醇含量

2.4 不同工業物料的搖瓶驗證

為了驗證S.C D12 在不同地區物料和不同配比物料中的發酵穩定性，我們選取了安徽地區工廠所用的糙米和小麥、廣西地區工廠所用水稻和小麥進行了不同比例的混合和發酵驗證，35 ℃搖瓶發酵66 h 后檢測葡萄糖和乙醇，其結果如圖5，可以觀察到S.C D12 在不同地區物料和不同配比的情況下依然能保持良好的發酵性能，具有很強的穩定性。

圖5 35 ℃不同地區物料與配比條件下的發酵成熟醪殘葡萄糖和乙醇

2.5 工業物料小試驗證

取肇東工廠生產線上的三期液化醪為發酵底物，對S.C D12與對照菌株進行發酵小試驗證。發酵分為控溫（32 ℃）和溫度調整（0～16 h、32 ℃，17 h、33 ℃，18 h、34 ℃，19～72 h、35 ℃）。對照菌株分別使用控溫和溫度調整組進行發酵，S.C D12 使用溫度調整組發酵并與對照菌株進行比較。發酵成熟醪酒精度如圖6 所示，在溫度調整的高溫情況下（35 ℃），工程菌株S.C D12乙醇產量為12.50%vol，較出發菌株提升了0.53%vol，殘總糖1.93 g/100 mL，較出發菌株降低了0.82 g/100 mL，S.C D12 在高溫下與對照菌株在正常溫度下的發酵性能相當，具有良好的穩定性。發酵產物HPLC 檢測結果見表1，菌株S.C D12 在高溫下的發酵各項指標均達到對照菌株正常控溫條件下的發酵性能。

表1 S.C D12菌株與對照菌株發酵HPLC數據(g/100 mL)

圖6 S.C D12菌株與對照菌株發酵結果

3 結論

與傳統的實驗室進化方法相比，對基因組進行改造后的菌株能極大的縮短實驗室適應性進化所需的時間，在數周內即可獲得優良的工業釀酒酵母。本研究中就基于此方法篩選獲得了1 株能高產乙醇的抗逆菌株S.C D12，工業物料小試發現，35 ℃高溫下仍然能保持良好的乙醇產量和較低的殘糖，且發酵性能與對照菌株在32 ℃下基本一致，適合于工業化生產，能極大的節約工業上冷卻水的使用，降低發酵成本。