結核桿菌抗酸染色與實時熒光PCR法檢測效果比較

史運林

摘要：目的：探討結核桿菌抗酸染色與實時熒光PCR法檢測效果比較。方法：統計分析我院2019年10月至2020年12月期間結核門診398例影像檢查疑似結核患者，同時進行涂片抗酸染色和實時熒光PCR結核菌DNA檢測進行效果比較。結果：實時熒光PCR結核菌DNA檢測敏感度、特異性對比與抗酸染色涂片法較高，P<0.05，數據指標之間具有統計學計算意義。作為肺結核的有效診斷方法，可以為臨床治療提供依據，值得推廣使用。

關鍵詞：結核桿菌;抗酸染色;實時熒光PCR

結核病及時準確的診斷，對結核病預防與治療，至關重要。結核病是結核分枝桿菌引起的慢性傳染病。實驗室檢測手段有細菌學檢查、免疫學檢測、分子生物學檢測。我科開展的檢測手段有抗酸染色、實時熒光PCR法結核分枝桿菌核酸檢測。抗酸染色涂片法要求設備簡單、實驗時間短、操作簡便、成本低廉等臨床優勢。結核桿菌核酸檢測法（實時熒光PCR法）對實驗室人員要求高，特異性強，敏感性高，大大地提高了檢測的準確度資料與方法。

1.1資料? 在2019年10月至2020年12月期間來院結核門診就診，影像學懷疑為結核病的398例患者，作為這次的分析對象。最大年98歲，最小年齡13歲。男性279例，女性119例。

1.2方法

抗酸染色：收集患者3份痰標本（即時痰、夜間痰和晨痰）進行痰涂片，痰涂片大小10mm x20mm，厚薄剛好透過報紙的5號字體，鏡下每個視野20個左右細胞。在痰片自然干燥后，用臘筆將涂面局部隔開，滴加石炭酸復紅染液，酒精燈上加熱至出現蒸氣。切勿沸騰，亦不可使染液干涸。如有干涸的趨勢，應及時補加染液。持續染色5-8分鐘，待冷后流水漂去多余的染液。用3%鹽酸酒精清脫色，脫至涂面無色為止，約1-3分鐘，自來水沖洗，滴加呂氏美蘭染液復雜30秒～1分鐘，自來水沖洗，自然干燥后油鏡觀察100個視野 ，查見有抗酸桿菌即為陽性。儀器使用奧林巴斯顯微鏡。

實時熒光PCR法結核分枝桿菌核酸檢測：收集患者3份痰標本（即時痰、夜間痰和晨痰），加入標本體積1-2倍的4%氫氧化鈉震蕩30分鐘左右完全液化，將液化后3份標本混合在一起，槍頭或吸管混勻后吸取0.5ml至1.5ml離心管中， 15000rpm離心5分鐘; 去上清，沉淀加無菌生理鹽水1ml打勻，15000rpm 離心5分鐘;再重復洗滌一次; 去上清，沉淀中加50μl DNA提取液充分混勻，沸水浴10 分鐘;12000 rpm 離心5分鐘，備用。實時熒光PCR? TB-DNA檢測是用一對結核分枝桿菌特異性引物和一條結核分枝桿菌特異性熒光探針，配以PCR反應液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸 v0123單體（dNTPs）等成分，用PCR體外擴增法檢測結核分枝桿菌DNA。試驗嚴格遵守試劑盒說明書實驗室SOP文件操作，如果Ct 值<30，則實驗結果為陽性。儀器使用eppendoye? centrifuge 5430 R低溫高速離心機，SLAN-96、熒光定量PCR擴增儀。試劑廠家是中山大學達安基因股份有限公司。

1.3 統計學方法

本次統計分析的來我院結核門診就診，影像學X光疑似為結核病的398例患者痰檢數據均率入到SPSS19.0 for Windows 統計學軟件實施處理，痰涂片抗酸染鏡檢法與結核桿菌DNA檢測符合率比較用率（%）的形式表示，采用卡方檢驗P<0.05，數據指標之間具有統計學計算意義。

2.結果

2.1 比較分析抗酸染色涂片法與實時熒光PCR法結核分枝桿菌核酸檢測陽性率符合情況。

檢測數據分析可見，398名檢測者中，痰涂片抗酸染色54例，陽性率13.57%;實時熒光PCR法結核分枝桿菌核酸檢測陽性112例，陽性率28.14%。敏感性、特異性對比與抗酸染色涂片法較高，P<0.05，數據指標之間具有統計學計算意義。

3.討論

結核病是人類疾病中最古老的傳染病之一，在全球傳染病中己成為成年人的首要死因。我國2019年新發結核病患者達到83.3萬例，死亡3.1萬例，從全球范圍來講，結核病問題不僅是一個健康衛生的問題，也是一個國計民生的經濟問題，還是一個可能牽連國家和地區能否穩定和發展的社會問題[1]。結核病是結核分枝桿菌引起的慢性傳染病，結核菌陽性患者是最主要的傳染源，痰檢是肺結核檢查診斷的有效手段。痰檢實驗檢測手段有痰涂片抗酸染色、實時熒光PCR? TB-DNA檢測、痰結核桿菌培養。痰結核桿菌培養快者2-3周，慢者2-3個月，時間周期長。為結核治療提供依據，及時準確的診斷結核病，有效地控制傳染源，對預防、治療結核病至關重要。

現階段，痰涂片抗酸染色與實時熒光PCR 檢測為最常見的實驗室檢測手段。痰涂片抗酸染色是利用結核分枝桿菌的細胞壁上的脂類不容易著色，對其延長染色的時間，細胞壁上的脂類著色后，不容易被 酸性脫色劑脫去 ，通過顯微鏡觀察視野中是否有被染成紅色的結核桿菌 ，來判斷臨床疑似肺結核的患者是否被結核分枝桿菌感染 ，這種方法具有操作方便 、價格便宜的優點 [2] ，但是痰涂片抗酸染色易受痰標本的質量、染色時間、工作人員的經驗情況的影響，造成漏檢。PCR技術具有高敏感性和高特異性，對標本要求較低，結核分枝桿菌極少的情況下也可檢出，利用實時熒光PCR法檢測結核分枝桿菌結果的準確性、穩定性及重復性大大提高。

通過用上述兩種方法進行效果比較，結論兩種檢測方法皆是臨床上迅速檢測結核分枝桿菌的有效方法，，其中熒光定量PCR敏感度高，應用在初篩中效果更為顯著[3]。實時熒光PCR? TB-DNA檢測作為肺結核的有效診斷方法，可以為臨床治療提供依據，值得推廣使用。

參考文獻：

[1] 朱國峰? 關注并引領結核病免疫學領域的基礎理論與創新技術發展 結核與肺部疾病雜志 ，2020，12（3）193-194。

[2]秦 慶 胡 瑛 呂永 強? 痰涂片抗酸染色、結核抗體試驗、熒光PCR、 T-SPOT.TB在肺結核診斷中的臨床意義? ?中國醫學科學 2017，11 （7） ，130-134。

[3] 梁少碧? 熒光寫量PCR和雙抗原夾心膠體免疫層析法檢測結核分枝桿菌的對比觀察 [M] 結核與肺部健康雜志 2013，6（20），112-114。