磁性納米探針的構建及其對細菌分離應用

溫聰穎， 訾 敏， 張瑞巧， 趙令今

（1.中國石油大學（華東）理學院，山東青島266580；2.青島市農業科學研究院，山東青島266100）

0 引 言

化學是一門以實驗為基礎的科學，實驗教學至關重要［1-2］，傳統實驗教學體系有助于培養學生的基本實驗技能，但不利于提高學生的綜合實驗能力和科研素養［3-5］，綜合研究型實驗已經成為傳統實驗教學的有益且必要的補充［6-8］。近年來，基于磁性納米材料的分離技術在分離和富集領域展現出極大的應用前景，分離對象可以是離子、小分子、生物大分子、病毒、細菌、細胞等［9-11］。相比于傳統的化學分離技術，磁分離方法具有操作簡便、成本低廉、條件溫和等優點［12-13］。因此，作為相關專業的大學生，非常有必要了解這方面的前沿知識并熟悉相關實驗操作。基于此，結合前期的科研工作［14-16］，本文設計了磁性納米探針的構建及其對細菌分離應用綜合研究型實驗，該實驗通過將磁性納米顆粒包埋到高分子球內部制得具有優良超順磁性的磁性納米球，并通過共價偶聯在磁球表面修飾大腸桿菌抗體，利用抗體對抗原的識別作用實現了大腸桿菌的特異高效的捕獲和分離。一方面該實驗將材料合成、表征、修飾、應用形成一套完整的科研訓練過程，極大地培養了學生的實驗技能、科研素養和創新精神；另一方面該實驗涉及磁性納米材料、細菌分離等科學研究熱點，有助于學生了解科學前沿進展并體會科學研究的魅力，從而激發學生學習的積極性以及從事科學研究的興趣。目前，該實驗已經在我校化學專業學生中示范開展，并取得了較好的教學效果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

試劑：氯仿、正丁醇、正己烷、乙醇、氯化鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉購自中國醫藥集團上海化學試劑公司；小鼠源抗大腸桿菌抗體、cy3染料標記的兔抗小鼠抗體、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、Hoechst 33342染色劑等購自Sigma-Aldrich公司；細菌培養基購自Oxoid公司；大腸桿菌、芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌由中國石油大學（華東）生物中心提供；油溶性磁性納米顆粒、表面帶羧基的多孔高分子球由本課題組合成［14］。

儀器：恒溫搖床，恒溫培養箱，生物超凈工作臺，超聲波清洗器，熒光倒置顯微鏡，磁力架，透射電子顯微鏡，分析天平，細菌比濁儀等。

1.2 磁性納米球的制備

取1.8 mL多孔高分子球于離心管中，16 000 r/min離心30 min，去掉上清，晾置5 min得到高分子球沉淀；與此同時，取500μL油溶性磁性納米顆粒，加入1.5 mL乙醇，12 000 r/min離心5 min，去掉上清，晾置5 min得到磁性納米顆粒沉淀；用600μL溶脹劑（570 μL正丁醇＋30μL氯仿配制而成）超聲分散磁性納米顆粒，然后加入到高分子球沉淀中，繼續用超聲波清洗器超聲30 min；用正己烷離心洗滌1次，乙醇離心洗滌2次；將所得沉淀分散到1 mL超純水中，超聲1 h，靜置過夜取上清即得磁性納米球。

1.3 磁性納米球的生物功能化

取250μL磁性納米球，用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 6.8）通過磁分選洗滌2次，分散到500μL磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 6.8）中，超聲分散均勻；同時用500μL磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 6.8）溶解10 mg EDC和5 mg NHS后迅速加入到磁性納米球中；混勻后置于搖床上150 r/min室溫反應30 min；將上述磁性納米球用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）洗滌2次，分散到1 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）中，加入50μg大腸桿菌抗體，置于搖床上150 r/min室溫反應4 h；將產物用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）洗滌5次，即得抗大腸桿菌免疫磁球，將其分散到250μL生理鹽水中，存于4°C冰箱待用。

1.4 細菌的培養、計數與染色

將大腸桿菌、芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌以劃線法分別接種到麥康凱（MacConKey）瓊脂培養基上，于37°C恒溫培養箱中培養24 h，挑取單個菌落分散到生理鹽水中制得細菌懸液，通過麥氏比濁法控制細菌懸液濃度約為108CFU/mL（0.5麥氏單位）。細菌懸液準確濃度的測量通過定量接種進行，具體操作為：將細菌懸液稀釋105倍，取100μL稀釋液定量接種到MH瓊脂培養基上，于37°C恒溫培養箱中培養24 h，對長出的菌落進行計數，再乘以稀釋倍數即換算為細菌原液的濃度。需要注意的是，細菌培養要保證無菌操作，以避免其他雜菌的污染。利用Hoechst 33342對細菌的DNA進行染色，具體操作為：在細菌懸液中加入Hoechst 33342，使Hoechst 33342的終濃度為30 μg/mL，置于37°C恒溫搖床上，避光反應30 min。

1.5 磁性納米球對細菌的捕獲和分離

將抗大腸桿菌免疫磁球加入到大腸桿菌懸液中，置于恒溫搖床上37°C下孵育30 min，利用磁力架進行磁分選，并用生理鹽水洗滌3遍，收集捕獲產物進行相關實驗。①將捕獲產物分散到超純水中，取10μL滴到碳支持膜上，放置過夜晾干，用透射電鏡進行觀察；②將捕獲產物用Hoechst 33342進行染色，置于熒光顯微鏡下通過紫外光激發進行觀察；③對加入的細菌的數量（N0）和捕獲后清液中剩余的細菌的數量Ns進行平板計數，通過下式計算捕獲率：

為了考察捕獲的特異性，同時將抗大腸桿菌免疫磁球加入到芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的懸液中，在搖床上孵育30 min后進行磁分選，收集捕獲產物染色后通過顯微鏡進行觀察，并計算捕獲效率。

2 結果與討論

2.1 磁性納米球的表征

本文所使用的高分子聚合物納米球表面親水，富含羧基，內部為疏水結構，在溶脹劑的作用下可以產生疏水空腔，通過超聲作用，油溶性的磁性納米粒子進入疏水空腔中，將納米球轉移到水相后，納米球迅速縮小，從而將磁性納米粒子禁錮在高分子球內部，制得磁性納米球。從磁性納米球的透射電鏡圖（圖1（a））可以看出，納米球的尺寸在250 nm左右，表面較為光滑平整，內部含有襯度更大的小顆粒，從而直觀地證明了磁性納米粒子進入了高分子球內部。進一步對磁性納米球的磁性能進行表征：磁性納米球的磁滯回線（圖1（b））表明磁性納米球具有優良的超順磁性，其矯頑力幾乎為零，飽和磁化強度達到19.3 A·m2/kg；且其磁響應迅速，將磁性納米球懸液用磁鐵吸引2 min，幾乎所有的磁性納米球均被吸引到靠近磁鐵的管壁上（圖1（c）），因此可以通過磁鐵方便地操縱磁性納米球。

圖1 （a）磁性納米球的透射電鏡圖；（b）磁性納米球的磁滯回線圖；（c）磁性納米球在磁力架（磁鐵）吸引不同時間下的照片

由于磁性納米粒子包埋到高分子球內部，因此高分子球表面的羧基幾乎不受影響，通過活化可以實現與抗體表面氨基的共價偶聯。利用免疫熒光的方法驗證了抗體是否成功偶聯到磁性納米球上：通過將未修飾的磁球和偶聯了小鼠源抗大腸桿菌抗體的免疫磁球分別與cy3染料標記的兔抗小鼠抗體孵育，磁分離并洗滌后，利用熒光顯微鏡觀察磁球表面是否存在cy3的紅色熒光。實驗結果如圖2所示，未修飾的磁球沒有熒光，而免疫磁球表面呈現出cy3的紅色熒光。這表明cy3標記的兔抗小鼠抗體（二抗）沒有和未修飾磁球發生反應，而與偶聯了小鼠源抗大腸桿菌抗體（一抗）的免疫磁球發生了免疫親和反應，從而證明了小鼠源抗大腸桿菌抗體被成功地修飾到磁球表面。

圖2 （A-B）未修飾的磁性納米球和cy3標記的兔抗小鼠抗體作用后的顯微鏡明場圖片和對應的熒光場圖片；（C-D）偶聯了抗體的免疫磁球和cy3標記的兔抗小鼠抗體作用后的顯微鏡明場圖片和對應的熒光場圖片

2.2 磁性納米球對細菌捕獲和分離效果

將免疫磁球分別加入到大腸桿菌懸液、芽孢桿菌懸液和金黃色葡萄球菌懸液中，反應后將捕獲產物用DNA染料Hoechst 33342進行染色，置于熒光顯微鏡下觀察，如圖3（A～F）所示，只有大腸桿菌組出現藍色熒光點，即為Hoechst 33342與大腸桿菌的DNA作用后在紫外光照射下發出的熒光，且與明場中磁球的團聚有良好的對應關系，而芽孢桿菌組和金黃色葡萄球菌組都沒有出現藍色熒光且磁性納米球分散良好，從而證明免疫磁球成功地捕獲到大腸桿菌，而沒有捕獲芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌。進一步對免疫磁球對細菌的捕獲率進行了定量計算（見圖4），免疫磁球對大腸桿菌的捕獲率達到了96%以上，而對芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的捕獲率不足3%。以上實驗表明免疫磁球具有良好的選擇性，可以通過抗原與抗體的結合特異性地識別和捕獲大腸桿菌。同時，采用透射電鏡對捕獲的大腸桿菌進行表征，結果如圖5（A-B）所示，圖片中的球狀物體即為免疫磁球，桿狀物體即為被捕獲到的大腸桿菌，大腸桿菌表面分布有免疫磁球，透射電鏡圖更為直觀地展示了免疫磁球和大腸桿菌的成功結合，說明免疫磁球能夠很好地識別目標細菌。

圖3 （A-B）免疫磁球捕獲大腸桿菌后的顯微鏡明場圖片和對應的熒光場圖片；（C-D）免疫磁球捕獲芽孢桿菌后的顯微鏡明場圖片和對應的熒光場圖片；（E-F）免疫磁球捕獲金黃色葡萄球菌后的顯微鏡明場圖片和對應的熒光場圖片

圖5 免疫磁球捕獲大腸桿菌的透射電鏡圖

3 結 語

本實驗合成了具有優良超順磁性的納米球，進一步在其表面偶聯大腸桿菌抗體，實現了大腸桿菌的特異高效的捕獲和分離。實驗內容豐富，從材料制備修飾到表征應用形成一套完整的科研訓練過程，涉及到生物偶聯、熒光標記、平板計數、免疫反應、捕獲分離等常規的化學及生物操作技術，以及透射電鏡表征、熒光顯微鏡表征、磁性表征等常規的表征方法。本實驗具有較強的綜合性、可操作性、前瞻性和新穎性，非常適合作為化學、生物、材料等相關專業的綜合實驗。通過在本校化學專業學生中示范開展，學生對實驗項目表現出極大的興趣和專注力，能夠積極主動地完成課題，并準確地分析實驗數據和結果。經過這一套完整的科研訓練，不僅極大地培養了學生的綜合實驗能力和分析問題解決問題的能力，而且有助于學生了解科學前沿并體會科學研究的魅力，從而激發其科研興趣并培育其科研素養。