固相萃取-高效液相色譜質譜法測定有機肥中18種抗生素殘留

冷遠鵬 薛曉康 孫華

摘要：建立了一種以固相萃取作為快速凈化技術的高效液相色譜質譜法測定有機肥中18種抗生素的殘留量，檢測目標物包括14種磺胺類物質及4種氟喹諾酮類物質。樣品經3 mL固相萃取柱快速凈化后直接經超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MSMS）外標法定量，流速0.4 mL/min，流動相為甲醇及0.1%甲酸水梯度洗脫，色譜柱為C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），進樣體積2 μL，正離子掃描多反應監測（MRM）模式，分析時長9 min。結果表明，有機肥基質對測試無明顯基質效應，目標化合物在10～250 μg/L 范圍內線性關系良好（r均大于0.995），方法檢出限為0.013～2.679 μg/kg，定量限為0.042～8.929 μg/kg，精密度良好，重復6次測試保留時間的RSD在5%以內，濃度的RSD在10%以內，空白加標回收率為89.2%～106.1%。豬糞、雞糞、鴨糞3個實際樣品高低2個水平加標回收率為70%～130%。說明該方法簡便可行、準確度可靠、靈敏度高，可為有機肥中抗生素測定標準制訂提供參考依據。

關鍵詞：固相萃取;高效液相色譜質譜法;動物糞便有機肥;抗生素

中圖分類號：X592? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）11-0146-07

收稿日期：2020-09-01

基金項目：上海市科委上海化學品公共安全工程技術研究中心項目（編號：18DZ2280700）。

作者簡介：冷遠鵬（1990—），男，貴州遵義人，碩士，中級工程師，從事化妝品、農藥殘留檢測相關研究。E-mail：lirper@163.com。

通信作者：薛曉康，博士研究生，高級工程師，主要從事化妝品、農藥殘留檢測相關研究。E-mail：xxk@ghs.cn。

抗生素是指由微生物或高等動植物所產生的一類次級代謝產物，其具有抗病原體或其他活性，能干擾其他生物的細胞發育功能[1]。抗生素按化學結構可分為酰胺類抗生素、喹諾酮類抗生素、氨基糖苷類抗生素、大環內酯類抗生素等，與其他類相比，喹諾酮類及酰胺類抗生素由于可直接化學合成、生產簡便且價格低廉，在獸藥中作為抗菌劑和促進生長劑被廣泛使用。然而，由于其性質穩定，僅少部分被動物完全代謝消耗，大部分則以原藥或次級代謝產物形式隨糞尿直接排出體外[2]。當動物排泄物用于發酵制作有機肥時，發酵堆肥環境有利于抗生素的穩定存在并可導致部分抗生素代謝產物反應轉化為原藥[3-7]。

抗生素污染目前備受關注，有機肥中抗生素到達土壤環境后將影響和改變農作區土壤菌落的原始結構和功能，對農田造成污染[8-10]，部分抗生素通過植物吸收進入食物鏈，最終對人產生毒害作用[11-16]，殘留在土壤中的抗生素還會誘導耐藥菌種出現，從而對生態環境產生二次污染[17-18]。

有機肥中抗生素殘留種類繁多，但目前我國的檢測指標僅為在2016年發布的GB/T 32951—2016《有機肥料中土霉素、四環素、金霉素與強力霉素的含量測定 高效液相色譜法》，還未建立有效檢測有機肥中喹諾酮類及酰胺類抗生素的方法。在限值規定方面，我國原農業部公告第235號規定了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中動物源性食品中磺胺的最高殘留限量為100 μg/kg，豬肌肉中喹諾酮限量為100 μg/kg。相對于肥料業，近年來食品業和環境業中抗生素殘留有了一定的研究[19-22]，但有機肥中喹諾酮類及酰胺類抗生素的檢測分析相關研究較少，目前也還沒有相關國家標準。

研究采用固相萃取法提取有機肥料樣品，聯用高效液相色譜質譜，以實現有機肥料中18種常見抗生素（14種磺胺類及4種氟喹諾酮類）殘留的同時、快速測定。已有3類有機肥樣品測試證明方法具有較高的準確度和精密度，以期為相關標準的制訂提供了參考，降低生態污染風險，保護生態和健康安全。

1 材料與方法

1.1 樣品

市售有機肥，基底為豬糞、雞糞或鴨糞單一動物糞種。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

ACQUITY TQD型高效液相色譜質譜聯用儀[美國沃特世（Waters）公司];PL2002型電子天平（梅特勒托利多集團）;TDL-5離心機（上海安亭科學儀器廠）;Oasis PRiME HLB固相萃取柱（規格為6 mL，美國沃特世公司）;pH計FE20（梅特勒托利多集團）;0.2 μm濾膜（美國沃特世公司）;2 mm 試驗篩（紹興市上虞紗篩廠）;Vortex 3000渦旋振蕩器[維根技術（北京）有限公司]。

1.2.2 試劑

所用化學試劑無特殊說明均為分析純，試驗用符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》的一級水標準。

（1）抗生素。磺胺吡啶、磺胺噠嗪、磺胺甲唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲異唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星，純度不小于95%。

（2）其他試劑。甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）、檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸。

1.3 溶液配制

1.3.1 緩沖溶液

（1）McLlvaine緩沖溶液。將1 000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液混合，用氫氧化鈉或鹽酸調節pH值為4.0。（2）Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液。濃度0.02 mol/L，稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉放入1 625 mL Mcllvaine緩沖溶液中，使其溶解，然后加入純水5倍稀釋，混勻。

1.3.2 標準溶液 分別稱取18種適量的獸藥標準物質，用甲醇溶解配制成100 μg/mL的標準儲備液，于-20? ℃冰箱中保存。吸取適量標準儲備液，用甲醇溶解配制成5 μg/mL的標準工作液，于-20 ℃ 冰箱中保存。吸取適量標準工作液，在試驗前用含5%甲醇、95%的甲酸水溶液（甲酸濃度0.1%）的初始流動相溶液配制濃度為10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L的標準溶液。

1.3.3 基質匹配標準溶液 吸取適量標準工作液，在試驗前用不含該18種抗生素、經樣品前處理的空白有機肥試樣溶液配制成濃度為10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L的基質匹配標準溶液。

1.4 樣品前處理

準確稱取2.0 g碾磨過篩后的有機肥樣品于50 mL 離心管中，加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaline緩沖液（pH值 4.0），渦旋混勻，再加入18 mL乙腈、2 mL乙酸，渦旋振蕩20 min后4 000 r/min 離心10 min，獲得含待測抗生素的上清液。取Oasis PRiME HLB固相萃取柱（吸附劑質量為60 mg，柱管體積為3 mL），將2 mL 上清液過固相萃取柱，保持約1滴/s的流速，準確量取1 mL流出液，過0.2 μm濾膜，獲得經固相萃取凈化的上機測試液。

1.5 色譜條件

色譜柱為C18柱，ACQUITY UPLC BEH（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）;柱溫為35 ℃;流動相：A，甲醇;B，0.1%甲酸水溶液;流速為0.4 mL/min;進樣體積為2 μL;梯度洗脫條件見表1。

1.6 質譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）;掃描方式為正離子掃描;檢測方式為多重反應監測（MRM）;脫溶劑溫度為350 ℃;脫溶劑氣流速為650 L/h;毛細管電壓：2.0 kV;18種抗生素質譜參數見表2。

1.7 試驗時間和地點

試驗時間為2019年6月至2020年6月;試驗地點為上海化工研究院有限公司（中國上海市云嶺東路345號）1號樓302室。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

配制濃度為100 μg/L的18種抗生素單標，利用ACQUITY TQD型高效液相色譜質譜聯用儀的質譜調節功能直接將標準溶液抽入質譜霧化進樣。調節錐孔電壓使母離子信號最大，再在此優化后的錐孔電壓下開啟碰撞，確定信號最強的子離子為定量離子并調節碰撞能量使子離子信號最大，確定信號次強的子離子為定性離子并調節碰撞能量使該子離子信號最大。優化后質譜條件如表2所示。

2.2 流動相的優化

以乙腈和甲醇溶液作為2種有機相進行18種抗生素混標溶液的進樣對比試驗。當乙腈作為流動相時，組分色譜峰較寬，分離度較低，且對于4種氟喹諾酮類抗生素出現峰拖尾現象，故確定有機流動相為甲醇。優化條件后標準溶液總離子流（TIC）色譜圖及定量離子對色譜圖如圖1、圖2所示，以甲醇為流動相，磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪及磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺-6-二甲氧嘧啶2組同分異構體均具有較好分離度，其具體情況如圖2中9、10、11、13、14號所示。

2.3 基質效應

目前常用于評估基質效應（ME）的指標為基質匹配標準曲線斜率/標準曲線斜率（ME值）。若ME值大于1.2時，說明基質對濃度越高的樣品具有越強的信號增強作用，即具有基質增強效應;若ME值低于0.8時，說明基質對濃度越高的樣品具有越強的信號抑制作用，即具有基質抑制效應;若ME值介于0.8～1.2之間時，說明基質無明顯基質效應[23]。如圖3所示，18種抗生素的ME值均在0.8～1.0之間，說明有機肥基質對抗生素信號有輕微抑制作用。但由于ME值均大于0.8，基質匹配標準曲線需要找到確定不含有這些抗生素的有機肥，經過前處理過程后方能獲得，不如用初始流動相直接配制的標準溶液使用方便，所以認為可忽略有機肥的基質效應。回收率試驗將進一步確定有機肥基質及本方法其他因素的影響。

2.4 方法學評價

2.4.1 線性關系、檢出限和定量限 取“1.3”節標準系列溶液，按“1.5”節色譜條件及“1.6”節質譜條件進樣，以抗生素濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程并確定相關系數（r），以3倍信噪比為檢出限（LOD）、10倍信噪比為定量限（LOQ）。如表3所示，18種抗生素在10～250 μg/L 濃度范圍內線性關系良好，相關系數r均大于0.995，方法檢出限為0.013～2.679 μg/kg，方法定量限為0.042～8.929 μg/kg。

2.4.2 精密度 向空白有機肥樣品中添加一定量標準儲備液后進行前處理，使上機溶液中抗生素理論濃度為 50.0 μg/L，按“1.5”節色譜條件及“1.6”節質譜條件連續進樣6次。如表4所示，抗生素保留時間的相對標準偏差（RSD）均在5%以內，濃度的RSD均在10%以內，空白加標回收率在89.2%～106.1%之間，說明方法精密度良好，前處理過程能夠有效提取出抗生素，液相色譜質譜分析能夠保持結果的穩定性及準確性。

2.4.3 實際樣品測定及加標回收率 以基底為豬糞、雞糞或鴨糞某單一動物糞種的市售有機肥，作為實際樣品進行抗生素及加標回收率測定，低水平加標濃度為20.0 μg/L、高水平加標濃度為160.0 μg/L。如表5所示，豬糞樣品中磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶有檢出，其余抗生素未檢出;雞糞樣品中氧氟沙星有檢出，其余抗生素未檢出;鴨糞樣品中磺胺吡啶、磺胺二甲異唑、磺胺間二甲氧嘧啶有檢出，其余抗生素未檢出。3種糞種的樣品加標回收率均在70.0%～130%之間，高低水平加標回收率無明顯差異，說明該方法適用于實際有機肥樣品中18種抗生素的測試。

3 結論

本研究建立了一種測定動物糞便基底有機肥中14種磺胺類抗生素、4種氟喹諾酮類抗生素殘留的固相萃取-高效液相色譜質譜法。樣品經提取凈化前處理后上機測試，9min即可完成單針分析。

初始流動相標準曲線與基質匹配標準曲線對比結果顯示，有機肥基底對測試無明顯基底效應，減輕了標線配制難度。方法準確度和精密度良好、靈敏度高，適用于動物糞種制成的有機肥中常見抗生素痕量殘留的分析檢測。鑒于目前沒有相關標準，本研究結果可為相關標準制訂提供依據。

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