山羊副流感病毒3型和巴氏桿菌混合感染的診斷與病原分離鑒定

惲佳蕾 毛立 楊蕾蕾 何苗峰 李文良 張紋紋 孫敏 劉茂軍

摘要：隨著規模化養羊業的發展，肉羊呼吸道疾病流行普遍、發病嚴重、防治困難，給養殖業及養殖戶造成較大的經濟損失。為明確安徽某肉羊養殖場呼吸道疾病的病因，結合流行病學、臨床癥狀、剖檢病變觀察、細菌學及病毒學檢測與分離鑒定以及血清學檢測對病因進行分析，結果表明該病是由山羊副流感病毒3型與巴氏桿菌混合感染所致。分離菌株對丁胺卡那霉素、氟苯尼考、阿奇霉素、恩諾沙星和頭孢曲松敏感，對青霉素、克林霉素和強力霉素不敏感。通過MDBK細胞成功分離獲得山羊副流感病毒3型毒株，其M基因片段與已有毒株同源性達99%。血清學檢測也進一步證實病毒的感染。這為臨床上科學防控山羊呼吸道疾病提供了指導和借鑒。

關鍵詞：山羊副流感病毒3型;巴氏桿菌;呼吸道疾病;混合感染;分離鑒定

中圖分類號：S858.27?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）11-0124-03

收稿日期：2020-12-06

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（19）3020];國家重點研發計劃（編號：2016YFD0500900）。

作者簡介：惲佳蕾（1996—），女，江蘇無錫人，碩士研究生，從事食源性/人獸共患傳染病防控技術研究。E-mail：834462138@qq.com。

通信作者：李文良，博士，研究員，主要動物重要病原感染致病機制與防控技術研究。E-mail：kfliwenliang@163.com。

近年來，隨著規模化養羊業的發展，肉羊呼吸道疾病流行普遍、發病嚴重、防治困難，給養殖業及養殖戶造成較大的經濟損失[1-3]。研究表明，與牛呼吸道疾病綜合征（BRDC）是由多種病毒、細菌感染導致的[4]類似，臨床上肉羊呼吸道疾病的發生可由多種病毒[如山羊副流感病毒3型（CPIV3）、小反芻獸疫病毒（PPRV）、呼吸道合胞病毒（RSV）]和細菌性病原（巴氏桿菌、曼氏桿菌、綿羊肺炎支原體、腸外致病性大腸桿菌、鏈球菌等）單獨或混合感染引起，尤其在機體健康狀態低下、環境改變、長途運輸等應激條件下引起嚴重的臨床癥狀[1，3，5-6]。

2020年9月，安徽一山羊養殖場外購育肥山羊（182頭）于到場后10 d陸續發生嚴重的呼吸道疾病，治療效果較差。發病羊主要表現為發熱、咳嗽、流涕、精神萎靡，嚴重者呼吸困難并出現死亡。剖檢2只病死羊均可見肺臟嚴重實變、化膿并與胸腔、心包膜黏連，胸腔積液，氣管出血并充滿泡沫與黏液。發病率約35%，死亡率8.2%。為查明病因，本研究結合流行病學、臨床癥狀、剖檢病變觀察、病原學、血清學檢測以及病原分離鑒定等方法對病因進行分析，明確致病病原，為該病的防治提供指導和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RNA/DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自Axygen公司;一步法RT-PCR試劑盒、胎牛血清、DNA分子量標準DL2000 plus，購自北京全式金生物科技有限公司;PCR Mix，購自南京諾唯贊生物科技有限公司;血平皿、藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司;革蘭氏染色液，購自北京索萊寶生物科技有限公司;DMEM培養基，購自Hyclone公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 細菌分離鑒定

1.2.1 染色與鏡檢 取肺、肝組織病料，涂布于綿羊血平板，37 ℃恒溫過夜培養，24 h后取出。挑取典型菌落涂片并進行革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.2 細菌16S rRNA序列測定 挑取純化的菌落，采用16S rRNA通用引物進行菌落PCR擴增，預期擴增片段為1 500 bp。引物序列如下：F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;R：5′-GGWTACCTTGTTACGACTT-3′。反應體系為20 μL，2×PCR buffer 10 μL，引物各為1 μL，提取的核酸4 μL，ddH2O 4 μL。反應條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環;72 ℃ 5 min，4 ℃保存。擴增后PCR樣品于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳觀察結果。用膠回收試劑盒將PCR擴增產物純化后，送南京擎科生物科技有限公司進行測序并對結果進行BLAST分析。

1.2.3 藥敏試驗 挑取純化培養的菌落，涂布血平板，用紙片法進行藥敏試驗。37 ℃培養一晝夜，觀察結果，根據美國臨床與實驗室標準化協會（CLSI）M100-S21標準判定敏感性[7]。

1.3 病毒與支原體檢測

分別取200 μL鼻拭子（2份）、肺臟組織勻漿上清（2份）樣品，按照RNA/DNA提取試劑盒說明書提取樣品中的核酸。分別使用CPIV3、RSV、PPRV、綿羊肺炎支原體的引物分別進行RT-PCR或PCR檢測（引物序列如表1所示），一步法RT-PCR和PCR反應均參照試劑說明書進行。取擴增產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.4 病毒分離與序列分析

選取CPIV3檢測陽性的鼻拭子樣品，參照文獻[6]方法采用MDBK細胞進行病毒分離、傳代，觀察細胞病變（CPE）情況，檢測病毒血凝價。采用RT-PCR檢測CPIV3，將擴增產物送南京擎科生物科技有限公司進行測序并進行BLAST分析。

1.5 血清學檢測

按照報道的阻斷ELISA方法[11]對發病期（15份，其中2份為剖檢羊）和1個月后（31份）采集的血清樣品進行CPIV3抗體檢測。

2 結果與分析

2.1 細菌分離鑒定

從肺臟、肝臟樣品中均分離到單一的透明、濕潤、光滑、不溶血的小菌落。染色后鏡檢可見大量革蘭氏陰性桿菌并呈兩極著染。菌落PCR后電泳結果顯示，得到的擴增的核苷酸片段與預期結果大小相符。測序表明，該菌株16S rRNA基因部分序列與巴氏桿菌同源性最高。藥敏試驗結果顯示，此菌對丁胺卡那、氟苯尼考、阿奇霉素、恩諾沙星和頭孢曲松敏感（表2）。

2.2 病毒檢測與分離鑒定

結果顯示，2份鼻拭子和1份肺臟樣品檢測到CPIV3為陽性，而RSV、PPRV和綿羊肺炎支原體均未檢出（圖略）。

選擇陽性的鼻拭子樣品經離心、過濾除菌后接種MDBK細胞進行病毒分離，接種后4 d可見細胞出現CPE，傳代至第二代時3 d即可出現明顯的CPE，5 d時細胞出現融合、死亡、脫落（圖1），與已有報道[6]一致。通過血凝試驗檢測第3代病毒血凝價為128。對第3代病毒進行RT-PCR檢測，結果為陽性（圖略）。將擴增產物純化后進行測序，并進行BLAST分析，與已報道CPIV3毒株同源性為99%。

2.3 CPIV3抗體檢測

采用阻斷ELISA方法檢測采集的血清樣品，結果見圖2。發病早期采集的15份血清樣品抗體陽性率為53.33%，但阻斷率不高，有6份樣品在臨界值（35%）左右，2份剖檢病死羊的血樣均為陰性。發病1個月后血清抗體陽性率為96.77%，絕大多數阻斷率達到70%以上，僅有1份為陰性。

3 討論

根據流行病學、臨床癥狀、病理觀察和實驗室檢測，綜合判定發病羊場為CPIV3和巴氏桿菌的混合感染。建議對發病羊隔離飼養，使用專用的器具與飼料等;對死亡羊尸體及圈舍、糞便等污染物進行無害化處理;對整個羊舍，尤其對發病羊舍及其污染的環境、器具等進行全面消毒，1～2 d/次;對發病羊使用氟苯尼考、氟尼辛葡甲胺和維生素C注射治療，療程3～7 d，同時采用氟苯尼考進行全群預防用藥2次，1周后病情逐步好轉，死亡率顯著降低，1個月后回訪已基本恢復正常。

近年來，隨著國內養羊規模化的發展，集約化增加、流通運輸頻繁，但相應的防疫措施不到位，相關疾病頻發，逐漸引起大家關注，其中呼吸道疾病造成的危害最為突出。臨床上肉羊呼吸道疾病的發生可由多種病毒和細菌性病原引起，疾病的嚴重程度與感染病原的致病性、混合感染的程度以及應激、飼養管理等有關。小反芻獸疫致病性強，自2014年流行以來已通過疫苗免疫得到有效控制，但仍有散發的病例[12-13]。養殖戶需提高防范意識，做好疫苗免疫，定期監測抗體水平，保證免疫效果。CPIV3是新近報道的羊源副流感病毒，其流行分布較廣，尚無疫苗和特效藥物，應給予重視并采取預防為主的措施[6，14]。此外，根據筆者所在實驗室調查發現，綿羊肺炎支原體流行普遍[15]，危害較大且缺乏針對性的疫苗，巴氏桿菌、曼氏桿菌、腸外致病性大腸桿菌等常與之混合感染。針對這些細菌性病原，應重視病原的檢測、鑒定，篩選敏感藥物進行治療。本病例中檢測到CPIV3與巴氏桿菌混合感染，未檢測到PPRV和綿羊肺炎支原體，該株巴氏桿菌耐藥性不強，但養殖戶最初使用的是不敏感藥物，根據檢測結果調整藥物并配合對癥支持治療藥物后即收到良好的效果，發病率和死亡率明顯下降并最終恢復正常。

總之，面對規模化養殖模式下肉羊呼吸道疾病多發難防的問題，養殖戶和研究人員均應給予足夠的重視，貫徹預防為主的綜合防控措施，發病后應結合流行病學和病原學檢測科學分析病因并采取針對性的防治方案，最大限度降低造成的損失。

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