Fas/FasL通路對鎘激活PC12細胞MAPK通路的影響

王 莉，陳 潔，聞雙全，鄒 輝，顧建紅，劉學忠，卞建春，劉宗平，袁 燕*

(1.揚州大學獸醫學院，揚州 225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009；3.南通市動物疫病預防控制中心，南通 226011)

鎘(cadmium，Cd)是一種存在于環境中的重金屬，與許多重金屬不同，Cd具有良好的水溶性，可經水體在土壤中富集并被植物吸收，通過食物鏈進入人和動物體內[1]。呼吸系統和消化系統是Cd進入機體的主要途徑[2]，Cd可通過Ca2+通道和金屬離子轉運蛋白進入細胞，并紊亂細胞內環境，引起細胞凋亡[3-4]。凋亡是細胞程序性死亡的方式之一，細胞凋亡的有序進行在維持細胞新陳代謝中發揮重要調控作用。誘導細胞凋亡是Cd的毒性作用機制之一。大腦是Cd富集和損傷的重要靶器官之一，Cd可以改變血腦屏障通透性，透過血腦屏障進入神經細胞，引起神經細胞凋亡[2,5]。

凋亡由不同的信號通路觸發，主要包括死亡受體通路和線粒體通路，其中，Fas/FasL通路是最為經典的死亡受體通路，參與調控多種細胞的凋亡[6]。Fas形成三聚體與配體FasL結合，再與具有死亡結構域的Fas相關死亡域蛋白(Fas-associated death domain，FADD)結合，進一步激活caspase-8引起細胞凋亡[7]。此外，由細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular-signal regulated protein kinases，ERKs)、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinases，JNKs)和p38/應激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinases，SAPKs)3個家族組成的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是介導細胞凋亡的另一重要通路[8]。研究表明，鎘可通過Fas/FasL通路[6]、線粒體通路[9]和MAPK通路[10]誘導神經細胞凋亡。此外，凋亡信號通路之間存在密切的串擾關系。MAPK信號通路可作為Fas/FasL信號通路的上游信號參與調控細胞凋亡。研究發現，抑制MAPK通路可抑制Fas/FasL通路的激活減輕磷脂酶A2(PLA2)誘導的人白血病U937細胞凋亡[11]。此外，Fas/FasL信號通路也可作為上游信號調控MAPK信號通路參與調控細胞凋亡。研究表明，抑制Fas/FasL通路可抑制MAPK通路的激活，緩解急性胰腺炎誘導的肝細胞凋亡[12]。本課題組前期研究發現，Fas/FasL通路可激活線粒體通路參與鎘致PC12細胞(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞)凋亡[13]。然而，在鎘誘導PC12細胞凋亡過程中，Fas/FasL通路對鎘激活MAPK通路的影響尚不明確。

本研究通過10 μmol·L-1醋酸鎘(cadmium acetate，CdAc2)分別處理插入非特異性序列 PC12細胞與Fas 基因沉默 PC12細胞12 h；用10 μmol·L-1CdAc2與40 μmol·L-1Z-IETD-FMK(caspase-8 特異性抑制劑)單獨或聯合處理PC12細胞12 h，通過流式細胞術檢測細胞凋亡率，Hoechst33258 熒光染色法檢測細胞凋亡形態學變化，Western blot法檢測Fas/FasL通路相關蛋白Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、死亡結構域相關蛋白(death domain associated protein，Daxx)、凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)與MAPK通路相關蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表達情況，旨在探討Fas/FasL通路對鎘激活PC12細胞MAPK通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗細胞株

PC12細胞(rat pheochromocytoma cell)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫(ATCC Number：CRL-1721)；Fas基因沉默PC12細胞株由本課題組前期構建。

1.2 主要試劑

RPMI 1640和胎牛血清(Life Technologies，USA)，L-谷氨酰胺和青鏈霉素(BBI，USA)，Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8兔多克隆抗體(Abcam，UK)，Daxx、ASK1、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2兔單克隆抗體(CST，USA)，β-actin和辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔二抗(CST，USA)，嘌呤霉素(Invitrogen，USA)，Fas shRNA慢病毒和NC shRNA慢病毒(山東維真生物科技有限公司)，L-多聚賴氨酸、Hoechst 33258、醋酸鎘(Sigma-Aldrich，USA)，Z-IETD-FMK(Abcam，UK)，別藻蛋白(APC)和7-氨基放線菌素 D(7-AAD)細胞凋亡雙染試劑(BD，USA)，其余試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器

DMI3000B型倒置顯微鏡(Leica，Germany)，EPOCH型酶標儀(BioTek，USA)，蛋白質電泳設備、轉膜設備及GIS-1000凝膠成像處理系統(BIO-RAD，USA)，Tanon化學發光成像分析系統(上海天能科技有限公司)，激光共聚焦顯微鏡(Leica，Germany)，FACS Aria型流式細胞儀(BD，USA)。

1.4 1640培養液配制

RPMI 1640培養基一袋(10.4 g)，碳酸氫鈉1.5 g，丙酮酸鈉0.1 g，葡萄糖2.5 g，完全溶解于800 mL超純水中，調節pH至7.2～7.4，定容至1 L。0.22 μm正壓濾膜器過濾除菌，分裝，4 ℃保存備用。使用前加入10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素，2 mL谷氨酰胺。

1.5 細胞培養

將PC12細胞、插入非特異性序列PC12細胞(NC組細胞)或Fas基因沉默PC12細胞(Fas shRNA組細胞)用RPMI 1640完全培養液于37 ℃、50 mL·L-1CO2培養箱中培養，當細胞融合率達到80%，進行傳代(1∶2～1∶4)培養。

1.6 Hoechst 33258 染色觀察細胞核形態的變化

將NC組和Fas shRNA組細胞以每孔1.0×105個細胞密度分別接種于加有玻璃爬片并用L-多聚賴氨酸包被的的24孔板中培養24 h(細胞處于對數生長期)，根據本課題組前期研究結果[13]，本研究選擇10 μmol·L-1CdAc2分別處理NC組細胞(Cd組)和Fas shRNA組細胞(Fas shRNA+Cd組)12 h，棄培養基，4%多聚甲醛4 ℃固定30 min，PBS漂洗2次，加入5 mg·L-1Hoechst 33258熒光染色液室溫避光孵育10 min，PBS漂洗2次，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率

將NC組和Fas shRNA組細胞以每孔1.0×106個細胞密度分別接種于6孔培養板上培養24 h(細胞處于對數生長期)，用10 μmol·L-1CdAc2處理NC組細胞(Cd組)和Fas shRNA組細胞(Fas shRNA+Cd組)12 h。處理完成后，收集細胞，離心棄上清，用1 mL PBS洗滌細胞2次。加入200 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，200目篩網過濾細胞至流式管中，別藻蛋白(APC)和7-氨基放線菌素D(7-AAD)各5 μL單獨或聯合處理，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞占總細胞比例和即為細胞凋亡率。

1.8 免疫印跡法檢測相關蛋白表達

10 μmol·L-1CdAc2分別處理NC組(Cd組)與Fas shRNA組(Fas shRNA+Cd組)PC12細胞12 h；或根據本課題組前期研究結果[13]，用40 μmol·L-1Z-IETD-FMK與10 μmol·L-1CdAc2單獨或聯合處理PC12細胞12 h。離心收集細胞，添加含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(1∶100)，超聲破碎細胞，于冰上裂解20 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度并將濃度調成一致，加入5×SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)上樣緩沖液，隔水煮沸8 min，于超低溫冰箱保存備用。蛋白樣品經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離后，轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應一抗，4 ℃孵育過夜，含吐溫20的三羥甲氨基甲烷緩沖液(TBST)洗滌6次，5 min·次-1，根據一抗來源孵育對應的HRP標記的二抗，室溫孵育2 h；含吐溫20的三羥甲氨基甲烷緩沖液(TBST)洗滌6次，5 min·次-1。利用Tanon化學發光成像系統進行增強性化學發光法(ECL)顯影檢測蛋白表達情況，Image Lab軟件分析灰度值，目的蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值，即為目的蛋白的相對表達量。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 PC12細胞Fas蛋白沉默的鑒定

Western blot檢測Fas蛋白表達量的變化，結果如圖1所示，NC組與Control組相比，Fas蛋白的表達量無顯著差異(P>0.05)；與NC組相比，Fas shRNA組Fas蛋白的表達量極顯著下降(P<0.01)。

不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)；相同字母表示組間差異不顯著(P>0.05)，下同Different capital letters show significant difference between groups (P<0.01)；no significant differences in the same letters (P>0.05)，The same as below圖1 PC12細胞Fas蛋白沉默的鑒定Fig.1 Identification of the silence of Fas protein in PC12 cells

2.2 Fas shRNA對鎘致PC12細胞凋亡的影響

10 μmol·L-1CdAc2分別處理NC組與Fas shRNA組細胞12 h，Hoechst 33258染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞核形態變化。結果如圖2所示，與NC組相比，Cd組中細胞核固縮濃染，呈典型凋亡形態變化的細胞核數量上升，細胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)，Fas shRNA組與Fas shRNA+Cd組細胞呈凋亡典型變化的細胞極少，細胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)；與Fas shRNA組相比，Cd組細胞呈典型凋亡形態變化的細胞核數量上升，細胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)，Fas shRNA+Cd組細胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)；與Cd組相比，Fas shRNA+Cd組細胞核固縮濃染，呈凋亡典型形態變化的細胞數量下降，細胞凋亡率極顯著降低(P<0.01)。

白色箭頭所示為受損細胞核The damaged nuclei were marked by white arrows圖2 Fas shRNA對鎘致PC12細胞核形態變化的影響(1 000×)Fig.2 Effects of Fas shRNA on nuclear morphological changes in PC12 cells caused by cadmium(1 000×)

10 μmol·L-1CdAc2分別處理NC組與Fas shRNA組細胞12 h，流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果如圖3所示，Q1象限為機械損傷細胞，Q2象限為晚期凋亡細胞，Q3象限為早期凋亡細胞，Q4象限為正常細胞。統計結果顯示，與NC組相比，Cd組細胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)，Fas shRNA組與Fas shRNA+Cd組細胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)；與Fas shRNA組相比，Cd組細胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)，Fas shRNA+Cd組細胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)；與Cd組相比，Fas shRNA+Cd組細胞凋亡率極顯著降低(P<0.01)。

圖3 Fas shRNA對鎘致PC12細胞凋亡率變化的影響Fig.3 Effects of Fas shRNA on the change of apoptosis rate in PC12 cells caused by cadmium

2.3 Fas shRNA對鎘致PC12細胞Fas/FasL通路相關蛋白表達變化的影響

10 μmol·L-1CdAc2分別處理NC組與Fas shRNA組細胞12 h，Western blot檢測Fas/FasL信號通路相關蛋白的表達情況。結果如圖4、圖5所示，與NC組相比，Cd組Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx、ASK1蛋白表達量均極顯著升高(P<0.01)，Fas shRNA組與Fas shRNA+Cd組Fas蛋白的表達量極顯著降低(P<0.01)；與Fas shRNA組相比，Cd組Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx、ASK1蛋白表達量均極顯著升高(P<0.01)，Fas shRNA+Cd組Fas、FasL、FADD、ASK1蛋白表達量差異不顯著(P>0.05)，Cleaved caspase-8蛋白表達量極顯著降低(P<0.01)，DAXX蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)；與Cd組相比，Fas shRNA+Cd組Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx、ASK1蛋白表達量均極顯著降低(P<0.01)。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)；下同Different lowercase letters indicate significant differences between groups (P<0.05)；The same as below圖4 Fas shRNA對鎘致PC12細胞Fas、FasL、FADD和Cleaved caspase-8蛋白表達變化的影響Fig.4 Effects of Fas shRNA on the changes of Fas，FasL，FADD and Cleaved caspase-8 protein expression in PC12 cells caused by cadmium

圖5 Fas shRNA對鎘致PC12細胞Daxx和ASK1蛋白表達變化的影響Fig.5 Effects of Fas shRNA on the changes of Daxx and ASK1 protein expression in PC12 cells caused by cadmium

2.4 Fas shRNA對鎘致PC12細胞ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影響

10 μmol·L-1CdAc2分別處理NC組與Fas shRNA組細胞12 h，Western blot法檢測ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2和p-JNK1/2蛋白表達情況。結果如圖6所示，與NC組相比，Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均極顯著升高(P<0.01)，Fas shRNA組與Fas shRNA+Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均無顯著差異(P>0.05)；與Fas shRNA組相比，Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均極顯著升高(P<0.01)，Fas shRNA+Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均無顯著差異(P>0.05)；與Cd組相比，Fas shRNA+Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均極顯著降低(P<0.01)。

圖6 Fas shRNA對鎘致PC12細胞ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影響Fig.6 Effects of Fas shRNA on the phosphorylation of ERK1/2 and JNK1/2 in PC12 cells caused by cadmium

2.5 Z-IETD-FMK對鎘致PC12細胞ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影響

10 μmol·L-1CdAc2與40 μmol·L-1Z-IETD-FMK單獨或聯合處理PC12細胞12 h，Western blot法檢測ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2和p-JNK1/2蛋白表達情況。結果如圖7所示，與Control組相比，Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均極顯著升高(P<0.01)，Z-IETD-FMK組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均無顯著差異(P>0.05)，Z-IETD-FMK+Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2比值極顯著升高(P<0.01)，p-JNK1/2 /JNK1/2比值無顯著差異(P>0.05)；與Z-IETD-FMK組相比，Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均極顯著升高(P<0.01)，Z-IETD-FMK+Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2比值顯著升高(P<0.05)，p-JNK1/2 /JNK1/2比值無顯著差異(P>0.05)；與Cd組相比，Z-IETD-FMK+Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均極顯著降低(P<0.01)。

圖7 Z-IETD-FMK對鎘致PC12細胞ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影響Fig.7 Effects of Z-IETD-FMK on the phosphorylation of ERK1/2 and JNK1/2 in PC12 cells caused by cadmium

3 討 論

細胞凋亡是由死亡信號觸發或內外環境變化，以及在基因調控下所引發的細胞主動死亡過程，是多細胞生物調控機體發育、維持內環境穩定、控制細胞衰老的重要機制。細胞凋亡的發生和進行受精確調控，具有獨特而復雜的信號轉導系統[14-15]。線粒體通路、死亡受體通路和內質網應激是細胞凋亡的3大經典通路，各通路之間相互交叉，共同調控細胞凋亡。鎘是誘導細胞凋亡的典型誘導因子之一。體內外研究結果表明，鎘可通過多種途徑誘導神經元[16]、星形膠質細胞[17]、小膠質細胞[18]、PC12細胞[19]等神經細胞發生凋亡。本課題組前期研究發現，鎘可引起神經細胞凋亡，上調Fas/FasL通路相關蛋白的表達量[20]，因此抑制Fas/FasL可能成為阻斷細胞凋亡的途徑。Wang等[21]研究發現，通過Fas siRNA沉默肝細胞Fas表達可以減少細胞凋亡，提高同種異體移植肝細胞的存活率。本試驗通過NC shRNA或Fas shRNA慢病毒干擾PC12細胞Fas蛋白表達。結果表明，NC shRNA慢病毒不影響PC12細胞Fas蛋白表達，可做為陰性對照進行后續試驗；Fas shRNA慢病毒可有效抑制PC12細胞Fas蛋白表達，減少鎘引起的細胞核固縮濃染或變形等細胞凋亡典型變化，顯著抑制鎘引起的PC12細胞凋亡率的升高，說明Fas/FasL在鎘致PC12細胞凋亡過程中具有重要作用。

死亡受體通路是靶細胞表面的死亡受體與配體結合導致死亡結構域(DD)與Fas相關死亡域(FADD)碳末端的DD結合，從而激活下游凋亡蛋白執行細胞凋亡的一種途徑[22]。Fas/FasL、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)和腫瘤壞死因子受體(TNFR)3大主要死亡受體通路中Fas/FasL通路是最主要的死亡受體通路之一，在神經細胞凋亡過程中扮演著重要角色。Fas/FasL通路由Fas/FADD/caspase-8和Fas/Daxx/ASK1兩條相對獨立的通路構成[23,24]。當細胞受到刺激物誘導發生凋亡時，Fas/FADD/caspase-8途徑被激活，參與細胞凋亡[25]。在此過程中，FADD作為紐帶將凋亡信號傳遞至細胞質[26]。Daxx是一種可以與Fas死亡結構域結合的蛋白，Daxx是Fas下游的一種促凋亡蛋白，與FADD平行，位于細胞核內，當細胞受到凋亡刺激時，Daxx可以與Fas結合，并依次激活ASK1和JNK，介導細胞發生凋亡，在此過程中ASK1在Fas介導的死亡受體通路和JNK通路之間發揮橋梁作用[22]。本試驗發現，鎘能夠激活PC12細胞Fas/FADD/caspase-8通路和Fas/Daxx/ASK1通路，引起Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx和ASK1蛋白表達量的升高；同時通過Fas shRNA抑制Fas的表達，能顯著抑制鎘引起的Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx和ASK1蛋白表達量的升高。說明抑制Fas的表達能夠阻斷鎘引起的PC12細胞Fas/FasL信號通路的激活。

MAPK通路的各亞族可被不同的外界刺激物激活，形成不同的信號轉導通路，激活不同的轉錄因子，介導不同的生物效應。MAPK通路的激活因細胞種類和誘導因子的不同存在很大差異。鎘可以引起大鼠膠質瘤細胞(C6)JNK和p38 MAPK激活，并通過p38 MAPK途徑調節絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)的表達[27]。此外，MAPK通路與線粒體通路和Fas/FasL通路之間存在密切的串擾關系。MAPK通路可作為線粒體通路和Fas/FasL通路的上游信號參與細胞凋亡的誘導。本課題組前期研究發現，鎘可通過ERK和JNK介導的線粒體通路誘導PC12細胞凋亡[28]。Liu等[11]研究發現，磷脂酶A2(PLA2)誘導人白血病U937細胞凋亡過程中，p38 MAPK與Fas/FasL通路被激活，p38 MAPK抑制劑SB202190抑制p38 MAPK的激活后，抑制了PLA2對Fas/FasL通路的激活。然而，Fas/FasL通路也可作為MAPK通路的上游信號參與細胞凋亡的誘導。TNF(腫瘤壞死因子)能夠誘導FADD和ERK激活，在FADD缺失的成纖維細胞中，TNF(腫瘤壞死因子)誘導的ERK磷酸化水平極顯著降低[29]。在Fas和FasL基因敲除的胰腺炎小鼠模型中，肝細胞凋亡水平顯著降低，同時p38 MAPK磷酸化水平也降低[12]。此外，Khelifi等[30]研究發現，通過RNA干擾(RNAi)技術抑制Daxx的表達，可顯著降低JNK的活性，提高成纖維細胞對紫外線和氧化應激的耐受性，降低細胞的凋亡率。本研究結果表明，Fas shRNA與40 μmol·L-1Z-IETD-FMK可抑制Fas/FasL通路的激活進而抑制鎘激活MAPK通路誘導的PC12細胞凋亡。說明Fas/FasL通路作為上游信號調控下游的MAPK通路參與鎘誘導PC12細胞凋亡。

4 結 論

通過Fas shRNA和Z-IETD-FMK抑制Fas/FasL通路的激活研究了鎘誘導PC12細胞凋亡過程中Fas/FasL通路對MAPK通路激活的影響。結果表明，抑制Fas/FasL通路可抑制鎘激活MAPK通路誘導的PC12細胞凋亡，如圖8所示。