交叉中和血清1型和血清3型鴨甲肝病毒單克隆抗體的制備與鑒定

劉 燕，湯 承，岳 華，王遠微*

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，成都 610041；2.廣漢市農業(yè)農村局，德陽 618300)

鴨甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)是引起雛鴨一種急性、高度接觸性、高致死性傳染病的病原[1]。我國是水禽養(yǎng)殖大國，近年來我國多省出現(xiàn)DHAV的疫情，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的損失[2-5]。根據(jù)基因序列特征和遺傳進化分析可將DHAV分為 3 個血清型，分別是血清1型(DHAV-1)、2型(DHAV-2)和3型(DHAV-3)[6-8]。2012年以前，我國大陸地區(qū)流行的DHAV主要是DHAV-1，2013年以后DHAV-3逐漸取代 DHAV-1 成為優(yōu)勢流行毒株，在所有流行毒株中3型DHAV占比57.1%[9]，且常常與DHAV-1混合感染[10]，流行毒株的改變給防控帶來了困難。DHAV-2主要在中國臺灣省發(fā)生，未在大陸地區(qū)流行過。鴨甲型肝炎防控以免疫防治為主，隨著不同血清型DHAV的流行趨勢的變化，疫苗的研究也向兩種血清型的二價疫苗方向發(fā)展[1，11-13]，并且已有批準的產品上市[14]。但是由于免疫失敗、免疫抑制以及母源抗體水平低等原因[15-16]，常常導致雛鴨的發(fā)病。所以傳統(tǒng)的鴨肝炎卵黃抗體仍然很受養(yǎng)殖企業(yè)和養(yǎng)殖戶的歡迎，針對DHAV-1和DHAV-3雙價卵黃抗體的研究也越來越多[17-18]，并且有雙價卵黃抗體獲批上市[19]。卵黃抗體雖然具有很好的臨床預防和治療效果，但是如果出現(xiàn)多血清型或者基因型混合感染往往會導致預防和治療失敗，造成損失。如果制備卵黃抗體的抗原所誘導的中和性抗體含量少，在產品效價低的情況下，也可能造成預防和治療的效果不理想。因此，對于鴨甲型肝炎的防控需要轉變策略和思路。廣譜中和單克隆抗體是可以中和不同毒株或者不同亞型的抗體，其廣譜性能夠在一定程度上解決混合感染導致的治療性抗體失去效果的問題，一些病毒的廣譜中和抗體被證明有較好的交叉保護效力[20-22]。其高效性大大提高治療性抗體的中和作用，提高治療效果。鑒于我國鴨甲肝病毒多血清型混合感染的情況[9-10]，研制DHAV的廣譜中和單克隆抗體對于該病的防控具有重要意義。

VP1蛋白是DHAV的外膜蛋白，是病毒變異發(fā)生的主要區(qū)域，但是VP1蛋白中又存在相對保守的區(qū)域，這些區(qū)域是該病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)[11,23]。研究發(fā)現(xiàn)DHAV-1和DHAV-3VP1基因之間的核苷酸序列(67.8%～72.0%)和氨基酸序列(67.6%～77.7%)都有一定的相似性，DHAV-3 VP1抗原可以與DHAV-1的陽性血清發(fā)生交叉反應[24-25]，因此DHAV-1和DHAV-3VP1基因間可能存在相同的抗原決定簇。也有研究報道VP1基因中可能存在適合作為中和抗體和受體結合的靶點[26]，可用于廣譜中和單克隆抗體研制。

本研究針對DHAV-1和DHAV-3 VP1共同抗原表位，制備與DHAV-1和DHAV-3發(fā)生交叉反應的單克隆抗體，并采用Real-time RT-PCR方法測定抗體對病毒增殖的抑制率、鴨胚中和試驗和雛鴨預防保護試驗鑒定單抗的中和活性，旨在篩選出具有廣譜中和活性的單克隆抗體，用于1型和3型DHAV感染的高效預防和治療。可達到一針防兩型和一針治兩型的效果，具有很大的應用前景，而其所識別的抗原表位也可為進一步研制鴨肝炎的廣譜卵黃抗體及治療性疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株及血清 DHAV-1(SMU3522)、DHAV-3(SMU3523)、新城疫病毒(NDV,SMU2185)和鴨瘟病毒(DPV,SMU2491)均由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室凍干保存，經蔗糖密度梯度離心純化后使用；禽流感病毒滅活抗原(AIV，H7 N7)，購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)有限公司。DHAV-1、DHAV-3、NDV、DPV、AIV鼠抗陽性血清均由本實驗室制備并保存。鼠陰性血清，自行采集后分離血清。

1.1.2 實驗動物與細胞株 6 周齡BALB/c雌性小鼠(SPF級)，體重20 g±2 g，購自成都達碩生物科技有限公司；SP2/0 小鼠骨髓瘤細胞和雜交瘤細胞株由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室保存；12日齡鴨受精卵(SPF級)，購自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所；1日齡健康雛鴨，購自成都克里莫育種有限公司。

1.1.3 主要試劑 小鼠McAb亞類鑒定用 ELISA試劑盒購自北京奧拓免疫技術有限公司；雙功能交聯(lián)劑 SMPH和羊抗鼠IgG-HRP由Thermo公司生產；改良型 R/MINI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清由Gibco公司生產；鑰孔血藍蛋白(KLH)載體蛋白和弗氏佐劑購自 Sigma公司；ELISA包被板由Corning公司生產；Dotblot 顯色液試劑盒由 Roche公司生產；硝酸纖維素膜由GE公司生產；總核酸提取試劑盒購自洛陽萊普生物生科技公司；反轉錄試劑盒和TB Green Ⅱ均購自大連寶生物公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 抗原表位肽的設計合成和偶聯(lián) 通過軟件比對本實驗室分離到的DHAV-1和DHAV-3流行毒株的VP1基因序列以及GenBank中的序列，篩選出 DHAV-1和DHAV-3 VP1蛋白共有的氨基酸序列的區(qū)域，設計 DHAV-1和DHAV-3共同的特異性抗原表位。設計的表位肽長度為14肽，設計原則避開信號肽、跨膜區(qū)、特殊結構、疏水區(qū)以及半胱氨酸含量多的區(qū)域。通過 NCBI網站上的BLAST工具確定抗原位點的保守性后，送上海生工生物有限公司進行合成。在肽段的 C-端添加半胱氨酸殘基，按照雙功能交聯(lián)劑 SMPH說明書的操作方法，將合成肽C-端上半胱氨酸殘基與 KLH 載體蛋白偶聯(lián)，作為小鼠免疫的抗原備用。同時，將合成肽與牛血清白蛋白(BSA)載體偶聯(lián)，作為檢測抗原備用。

1.2.2 動物免疫 將設計的抗原肽制備的抗原混合為兩組，1～6號為1組，7～12號為1組，然后分別與弗氏完全佐劑和不完全佐劑乳化后腹腔皮下注射免疫 3只BALB/c小鼠，每次免疫100 μg·只-1，每2周免疫1次，共免疫5次。5免后小鼠眼底靜脈采血，采用間接ELISA方法檢測小鼠血清的效價，抗原肽抗原包被10 ng·孔-1，用5%脫脂乳PBST封閉2 h，小鼠血清1∶4 000起始，4倍倍比稀釋，一抗37 ℃孵育1 h，羊抗鼠IgG酶標二抗稀釋度為1∶5 000，37 ℃孵育45 min；加顯色液37 ℃ 顯色15 min，加入終止液后讀取OD450nm吸光值，經過方法的優(yōu)化，OD450nm值大于0.25對應的血清稀釋度判斷為小鼠血清效價。選擇抗血清效價大于1∶8 000 的小鼠脾，用于雜交瘤細胞的制備。

1.2.3 陽性雜交瘤細胞的篩選與克隆 取血清效價大于 1∶8 000 的免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按照參考文獻[27]的方法進行融合，融合后培養(yǎng)良好的細胞，抽取上清液用“1.2.2”的間接 ELISA 方法檢測，一抗稀釋度為1∶1 000，羊抗鼠IgG酶標二抗稀釋度為1∶5 000。將檢測結果為陽性且只有單個細胞的細胞孔細胞進行亞克隆，經過3次同樣操作克隆化，直至所有克隆化細胞孔ELISA檢測陽性率為100%，獲得雜交瘤細胞株。

1.2.4 小鼠腹水的制備及效價測定 取1×106個·mL-1的陽性雜交瘤細胞腹腔注射BALB/c雌性小鼠制備腹水，用Dot blot方法檢測小鼠腹水抗體的效價。將BSA偶聯(lián)的多肽蛋白點到硝酸纖維素膜上(每個點 2 μL)，分別含有 25.00、5.00、1.00、0.25、0.05、0.01 ng偶聯(lián)的多肽，5%脫脂乳/TBS-T 37 ℃封閉 1 h。用 1∶1 000 稀釋的腹水37 ℃ 孵育1 h，TBS-T洗3次，1∶5 000的羊抗鼠IgG酶標二抗 37 ℃孵育 45 min，TBST 洗滌3次。最后加入ECL試劑，加封保鮮膜，在暗室曝光X-ray膠片顯影。當抗體的靈敏度小于0.25 ng時，抗體效價視為合格。

1.2.5 腹水中單抗交叉反應活性的鑒定 交叉反應活性的鑒定采用本實驗室已建立的DHAV-1和DHAV-3的ELISA方法進行，用按文獻[28]的方法純化的 DHAV-1和DHAV-3 病毒液包被ELISA板，包被濃度為 4 μg·mL-1，100 μL·孔-1，37 ℃包被2 h，3% BSA 37 ℃封閉1 h，McAb (一抗)做3個稀 釋度，分別為 1∶500、1∶5 000、1∶50 000，一抗(小鼠腹水抗體)孵育時間為1 h，羊抗鼠IgG酶標二抗稀釋度為 1∶10 000，二抗孵育時間為0.5 h，最后顯色，ELISA吸光值高于陽性血清的吸光值判為有交叉反應，測定12株McAb對DHAV-1 和 DHAV-3的交叉反應性。

1.2.6 McAb特異性鑒定 McAb特異性鑒定分別按照本實驗室已建立的 DPV、NDV 和 AIV 的間接 ELISA 方法進行，分別用純化的 DPV、NDV和AIV包被 ELISA 板，5% BSA作為封閉液，37 ℃ 封閉的時間分別1、2和1 h，一抗(小鼠腹水抗體)的稀釋度分別為1∶1 000、1∶1 000和1∶1 500，孵育時間均為1 h，羊抗鼠IgG酶標二抗的稀釋度分別1∶7 000、1∶10 000和1∶8 000，孵育時間均為0.5 h，操作步驟參照 ELISA 的常規(guī)操作步驟進行。

1.2.7 McAb體亞型鑒定 按照北京奧拓免疫技術有限公司的小鼠McAb亞類鑒定ELISA 試劑盒說明書進行McAb亞型的鑒定。

1.2.8 McAb對DHAV-1和DHAV-3抑制率的測定 取用0.45 μm濾器過濾的McAb 100 μL分別與等體積200ELD50的DHAV-1(ELD50：10-7.5·0.2 mL-1)和DHAV-3(ELD50：10-6.5·0.2 mL-1)混勻；同時用100 μL PBS緩沖液分別與等體積200 ELD50的DHAV-1和DHAV-3混勻，作為病毒對照組。37 ℃孵育1 h后，待測的各個McAb分別尿囊腔接種20枚12日齡鴨胚(0.2 mL·枚-1)，其中McAb與DHAV-1接種5枚，McAb與DHAV-3接種5枚，PBS與DHAV-1接種5枚，PBS與DHAV-3接種5枚。然后每天觀察3次，棄去24 h內死亡的鴨胚，收集24～84 h內死亡鴨胚，接種84 h后將存活鴨胚置4 ℃冰箱過夜，收集各組所有鴨胚肝提取RNA，按照Prime ScriptTMRT試劑盒的說明書的方法反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，采用Real-time RT-PCR方法[29-30]分別擴增DHAV-1、DHAV-3，以鴨β-actin作為內參基因[10]，利用2-△△Ct法進行相對定量分析，比較各組鴨胚肝中病毒荷載量，計算McAb對病毒繁殖的抑制效率。

1.2.9 McAb中和效價的測定 取用0.45 μm濾器過濾的McAb，用PBS倍比稀釋為2-1、2-2、2-3、2-4、2-5共5個梯度，分別與等體積的200ELD50DHAV-1和DHAV-3病毒液混和，37 ℃孵育1 h后，接種于12日齡的SPF鴨胚尿囊腔，每個濃度梯度接種5枚胚(0.2 mL·枚-1)，接種后的鴨胚放回37 ℃孵化箱中繼續(xù)孵化，每天觀察3次，棄去24 h 內死亡的鴨胚，記錄24～120 h內死亡和存活的鴨胚數(shù)量，根據(jù)Reed-Muench公式計算得出每株McAb分別對DHAV-1和DHAV-3的中和效價。

1.2.10 McAb對DHAV-1和DHAV-3的攻毒保護率測定 根據(jù)McAb對DHAV增殖的抑制率和McAb對DHAV中和效價，選出對DHAV中和效果最好的幾株McAb，評價各株McAb對DHAV感染的預防效果。將1日齡雛鴨按照隨機分10個組(10只·組-1)，分別為試驗1～8組和對照1～2組。試驗1～4組分別腿部肌內注射C1、C4、C7、C16 McAb(1 mL·只-1，對DHAV-1病毒的瓊擴效價為1∶256)，試驗5～8組分別腿部肌內注射各個McAb(1 mL·只-1，對DHAV-3病毒的瓊擴效價為1∶256)，對照1～2組注射等量PBS。注射McAb后24 h，試驗1～4組和對照1組注射DHAV-1病毒(100 LD50·只-1)，試驗5～8組和對照2組注射DHAV-3病毒(100 LD50·只-1)。攻毒后繼續(xù)飼養(yǎng)，每天觀察3次，記錄雛鴨的健康狀況和每組死亡雛鴨的數(shù)量，剖檢死亡雛鴨觀察病變情況，連續(xù)觀察8 d，并對每株McAb保護效果進行統(tǒng)計分析，計算各McAb的保護率。

2 結 果

2.1 設計合成的抗原肽

DHAV-1和DHAV-3的VP1蛋白共有的氨基酸序列的區(qū)域為238個氨基酸，用SEALTM 軟件設計的表位分析圖如圖1，綠色小方塊代表設計表位的位置，避開了信號肽、跨膜區(qū)、特殊結構、疏水區(qū)以及半胱氨酸含量多的區(qū)域，同時又是DHAV-1和DHAV-3共有的氨基酸區(qū)域，設計合成12條長度為 14 aa的肽段，見表1。

表1 共有抗原表位的信息Table 1 Information of shared epitope

圖1 DHAV-1和DHAV-3 VP1 蛋白共有表位氨基酸序列的分析結果Fig.1 Epitope analysis of VP1 amino acid sequences shared by DHAV-1 and DHAV-3

2.2 雜交瘤細胞株的篩選

雜交瘤細胞經3次亞細胞克隆純化和間接 ELISA 方法篩選，共得到12株雜交瘤細胞，分別為C1、C2、C3、C4、C5、C7、C9、C10、C12、C13、C14、C16。

2.3 小鼠腹水效價

用 Dot blot 方法檢測小鼠腹水效價，12 株雜交瘤細胞制備的小鼠腹水中抗體Dot blot檢測的靈敏度均小于或等于0.25 ng(表2)，說明抗體效價水平能滿足后續(xù)篩選之用。

表2 斑點印跡檢測McAb的效價Table 2 Dot blot titers of McAb

2.4 McAb交叉反應性鑒定以及亞型鑒定

間接 ELISA 結果顯示，12株雜交瘤細胞制備的抗體中，有6株可以同時和DHAV-1 和 DHAV-3 病毒發(fā)生特異性反應，ELISA的OD450 nm吸光值均顯著大于DHAV-1和DHAV-3的陽性血清(P≤0.05)，編號分別是 C1、C4、C7、C12、C13、C16，見表3，可用于后續(xù)試驗。它們的亞型分別為IgG1、IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG2b、IgG2a。

表3 McAb交叉反應性鑒定結果(OD450 nm值，Table 3 Results of McAb cross-reactivity identification

2.5 McAb的特異性

6株雜交瘤細胞的抗體分別與 DPV、AIV 和 NDV 抗原進行 ELISA 反應，結果顯示，C1、C4、C7、C12、C13和C16 OD值均分別顯著小于 NDV、AIV和 DPV陽性血清的OD值(P≤0.05)，與NDV、AIV和DPV陰性血清的OD值接近，見表4。按照實驗室已建立的 DPV、NDV和AIV的ELISA方法的判斷標準進行評價，說明這6株McAb不與NDV、AIV 和DPV的抗原發(fā)生反應，特異性較好。

表4 McAb特異性鑒定結果(OD450nm值，Table 4 Specific identification of the McAb

2.6 McAb對DHAV在鴨胚中增殖的影響

2.6.1 McAb對DHAV-1增殖的影響 對各組鴨胚肝中DHAV-1病毒的定量檢測結果及相對定量處理數(shù)據(jù)見表5。從表5可見，6株McAb C1、C4、C7、C12、C13和C16株對DHAV-1的增殖均有不同程度的抑制作用，抑制率分別為84.40%、90.79%、86.23%、14.74%、38.87%、和99.61%；其中C1、C4、C7和C16株對DHAV-1抑制率大于50%，表明上述4株McAb對DHAV-1在鴨胚中的復制均具有顯著的抑制作用。McAb C4和C16對DHAV-1的抑制率分別達到90.79%和99.61%，為所有McAb中效果最佳。

2.6.2 McAb對DHAV-3增殖的影響 對各組鴨胚肝中DHAV-3病毒的定量檢測結果及相對定量處理數(shù)據(jù)見表5。從表5可見，C1、C4、C7、C12、C13和C16株對DHAV-3增殖的抑制率分別為82.69%、75.34%、99.83%、25.26%、2.06%和100%；6株中C1、C4、C7、C16對DHAV-3抑制作用高于50%，其中C7、C16的抑制率分別高達99.83%和100%。

表5 6株單克隆抗體對DHAV-1和DHAV-3增殖的抑制情況Table 5 Inhibition of DHAV-1 and DHAV-3 proliferation by 6 strains of monoclonal antibodies

2.6.3 McAb對DHAV-1和DHAV-3的交叉中和活性 對上述6株McAb對DHAV-1和DHAV-3的抑制情況分析發(fā)現(xiàn)，C1、C4、C7、C16株對兩種血清型的DHAV在鴨胚中的復制都具有很強的抑制作用，說明這4株McAb對DHAV-3和DHAV-1具有良好交叉中和作用，其中C12有微弱的交叉中和活性，而C13則幾乎沒有交叉保護活性，如圖2。

圖2 6株單克隆抗體對DHAV-1和DHAV-3增殖的抑制情況Fig.2 Inhibition of DHAV-1 and DHAV-3 proliferation by 6 strains of monoclonal antibodies

2.7 McAb的中和效價

McAb中和效價測定結果顯示，C7對DHAV-1和DHAV-3的中和效價是所有McAb中最高的，分別是1∶10和1∶11；C16對兩種血清型毒株的中和效價均為1∶9；C1對DHAV-1和DHAV-3的中和效價分別為1∶3和1∶5；C4對DHAV-1和DHAV-3的中和效價均為1∶3；C12、C13對DHAV-1和DHAV-3均無中和效價。

2.8 McAb攻毒保護率

統(tǒng)計試驗中各組雛鴨的死亡數(shù)，分別計算4株McAb對DHAV的攻毒保護率，結果如圖3、4。從圖中可以看出C7和C16對兩種血清型病毒感染雛鴨都具有良好的保護作用，C7對DHAV-1和DHAV-3病毒保護率分別為70%、80%，C16對DHAV-1病毒的保護率達到100%，對DHAV-3病毒的保護率為60%。而C1和C4對DHAV-1和DHAV-3病毒保護率相對較低，分別為30%&40%、40%&40%，但仍然具有一定的保護力。病毒對照組(DHAV-1 和DHAV-3)的雛鴨全部死亡，死亡率為100%，死亡雛鴨均表現(xiàn)出典型鴨肝炎的臨床癥狀和剖檢變化。

圖4 DHAV-3攻毒組雛鴨生存曲線Fig.4 Duck survival curve of DHAV-3 virus challenge group

3 討 論

McAb可以與病毒發(fā)生中和反應，降低病毒對動物機體組織破壞，減少動物體內病毒數(shù)量，可以有效地提升疾病治愈率[31]。McAb在動物疫病的防控和治療中應用廣泛，同時也可作為新型檢測方法和治療手段開發(fā)的基礎，此外McAb在病毒結構的分析、中和表位的鑒定、免疫學診斷以及抗病毒治療方面也發(fā)揮著重要的作用[1]。關于DHAV的McAb研究方面也有諸多進展，李曉軍等[32]用純化的DHAV-1型病毒作為抗原免疫小鼠后得到了10株McAb，其中有6株McAb與DHAV-1和3型的DHAV的病毒都能產生交叉反應。夏琳琳[33]用DHAV-3的全病毒為抗原制備的McAb與DHAV-1也能發(fā)生特異性的反應，但是反應效果較3型的弱。張瑞華等[24]使用DHV VP1蛋白制備的McAb 4F8對DHAV-1和DHAV-3都有微弱的中和作用。上述研究表明，DHAV-1和DHAV-3病毒間確實存在共有抗原表位，這為開發(fā)具有交叉中和活性McAb的研究奠定了理論基礎。

本研究綜合考慮信號肽、跨膜區(qū)、特殊結構、疏水區(qū)、胱氨酸含量多的區(qū)域以及抗原位點的保守性和種屬特異性等因素來設計篩選特異性的抗原表位，顯著提高了抗原位點選擇的準確性。將與 KLH 載體蛋白偶聯(lián)的抗原多肽片段作為免疫原，用常規(guī)McAb制備技術共獲得了 12 株雜交瘤細胞株，并大量制備相應的抗體腹水，經間接 ELISA 檢測，證明其中 6 株細胞的抗體可以同時識別 DHAV-1和 DHAV-3 病毒，為特異性McAb。中和試驗顯示其中4株McAb具有廣譜中和活性。攻毒保護試驗確定了C7和C16 2株McAb對DHAV-1和DHAV-3交叉中和效果最佳。篩選到其中6株細胞產生的抗體同時識別 DHAV-1和 DHAV-3 病毒，而另外6株與兩個亞型病毒都不反應，出現(xiàn)這樣的結果的可能原因是篩選單克隆細胞株時ELISA包被的抗原是抗原表位肽，而進行交叉反應性試驗時ELISA包被抗原是全病毒，不發(fā)生反應的6株雜交瘤細胞所識別的抗原表位肽在全病毒中可能被包裹在內部或者具有空間結構，所以產生的抗體不與全病毒發(fā)生反應。本研究篩選到的12株雜交瘤細胞所對應的抗原表位雖然未公布，但是對12株雜交瘤細胞所對應7個抗原表位進行分析發(fā)現(xiàn)，C7和C16 2株單抗所針對的表位相同，但產生的中和活性卻有差異，C7對DHAV-1、DHAV-3病毒保護率分別為70%、80%，C16分別為100%和60%。導致中和活性差異的原因很多，其中抗體的亞型便是其一，但是本研究的亞型鑒定發(fā)現(xiàn)，C7和C16的亞型相同，均為IgG2a，因此排除這方面原因。還有研究證實，蛋白質的序列或結構特征在一定程度上影響著抗原表位生物學特性[34-35]，而且受到蛋白質二級結構的影響較大。范衛(wèi)國等[36]研究發(fā)現(xiàn)DHAV VP1結構蛋白的二級結構較為復雜，含有較多的β片層結構和轉角結構，有多個區(qū)域為B細胞優(yōu)勢表位。黃良宗等[37]表明DHAV VP1蛋白C端第132～137、177～186、209～219區(qū)段有較好的親水性、表面可及性和較高的抗原指數(shù)，并且在二級結構上含有易形成抗原表位的無規(guī)則卷曲和β-轉角，可能是VP1蛋白的B細胞抗原優(yōu)勢表位。C7和C16所識別的抗原表位相同，表位序列包括132～137區(qū)段，有較多而復雜的二級結構，所以可能是所識別的二級空間結構的差異導致了保護率的不同。

國內分別針對DHAV-1 和 DHAV-3 制備的McAb有很多研究報道[32,38-40]，本研究通過比對 DHAV-1 和 DHAV-3 多個流行毒株的 VP1 蛋白基因序列，找到DHAV兩個血清型病毒共有的保守的序列，然后設計抗原表位多肽作為抗原制備了McAb，與只針對一個血清型的McAb相比，可以同時中和兩血清型的不同毒株，具有廣譜中和活性。張瑞華等[24]、汪銘書等[41]研制出同時識別 DHAV-1 和 DHAV-3的McAb。但是這些研究都只證明了McAb可以同時與DHAV-1 和 DHAV-3發(fā)生交叉反應，汪銘書等沒有檢測McAb對兩個血清型病毒的中和活性，張瑞華等研制的McAb對DHAV-1 和 DHAV-3只有微弱的中和作用。因此推斷他們研制的McAb針對的表位只有識別功能而沒有中和活性，比較適于檢測方法的研究，不能應用于防控或治療。而本研究通過測定McAb對兩種血清型病毒增殖的抑制率、中和效價以及攻毒保護效力，證實所篩選的McAb對兩種血清型病毒具有很好的中和活性，可以用于DHAV的防控和治療，具有很好的應用前景。

中和活性很好的C7和C16兩株McAb所對應的抗原表位的序列是已知的(已測未公布)，可以人工合成后使用，能大大降低生產成本。該抗原表位可作為免疫原研制亞單位疫苗，用于免疫預防。還可以用于制備廣譜中和活性的卵黃抗體，制備的卵黃抗體不僅可以預防DHAV兩種血清型病毒的感染，而且具有更高的防治效力，從而為我國鴨病毒性肝炎的預防和治療產品的開發(fā)提供新思路。McAb雖然具有很好的治療和預防效果，但是生產成本高昂，用于臨床生產價格過高，不利于推廣使用。同時抗原表位肽屬于小分子物質，免疫原性比較差，所以不管是作為亞單位疫苗還是作為制備廣譜中和活性的卵黃抗體的抗原都有局限性。因此本研究的后續(xù)工作是，第一，McAb鴨源化的研究。第二，提高抗原表位肽的免疫原性的研究。

4 結 論

成功研制出對1型和3型DHAV具有交叉中和活性的McAb 4株，其中2株對病毒的感染具有良好的預防效果，可用于1型和3型DHAV感染的高效預防和治療，具有很好的應用前景，同時也為DHA的防控提供了新思路。