超高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中非法添加物福莫特羅和阿福特羅

趙立軍，張 靜，岳 琴，林順全，廖 峰，李 云

（農業農村部飼料質量監督檢驗測試中心（成都），成都610041）

β-受體激動劑是類似腎上腺素和去甲腎上腺素功能的化學合成藥物，其基本化學結構為苯乙醇胺。臨床上主要用于治療支氣管炎和哮喘等疾病[1-3]，該類藥物用于畜牧生產，俗稱“瘦肉精”，能顯著提高動物胴體瘦肉率和提高飼料轉化率，達到動物快速增重的目的[4-5]。有研究報道，β-受體激動劑易蓄積殘留于動物體內，特別在肺臟、肝臟、腎臟殘留量最高，嚴重危害人體健康[6-8]。福莫特羅是一種新型、高選擇性的β-受體激動劑，臨床上其具有強力而持續的支氣管擴張作用，效果明顯優于同等劑量的沙丁胺醇和特布他林[9]。福莫特羅分子中有兩個手性中心，即存在RR、SS、RS和SR四種構型。阿福特羅是福莫特羅的RR構型對映異構體，其藥效約為SS構型對映異構體的1 000倍[10-11]。我國農業農村部（原農業部）1519號公告明確禁止在飼料和動物飲用水中使用酒石酸阿福特羅（Arformoterol tartrate）和富馬酸福莫特羅（Formoterol fumatrate）等β-受體激動劑[12]。

目前有關飼料中β-受體激動劑的液相色譜質譜檢測方法很多，但主要關注的是“瘦肉精”測定[13-16]，尚無關于飼料中福莫特羅和阿福特羅總量的測定方法的報道。福莫特羅和阿福特羅是國家明令禁止在動物養殖中使用的物質，只要在飼料產品中檢出兩者中任何一種物質即判定為有非法添加物。為了使兩種物質檢測方法具有可操作性和實用性，本研究利用實驗室常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱建立了一種準確、靈敏的超高效液相色譜-串聯質譜法測定福莫特羅和阿福特羅。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯質譜儀（Agilent1290-6460 Triple Quad）、固相萃取裝置，美國Agilent公司產品；電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司產品；渦旋振蕩混合器，德國IKA公司產品；離心機，日本Hitachi公司產品；氮吹儀，美國Organomation公司產品；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品。

富馬酸福莫特羅、酒石酸阿福特羅對照品（純度≥98%）、福莫特羅-D6同位素內標物（純度≥96%），加拿大TRC公司產品；Oasis MCX固相萃取柱（3 mL·60 mg-1），美國Waters公司產品；甲醇、甲酸（色譜純），美國Sigma公司產品；鹽酸（分析純），重慶川東化工（集團）有限公司產品；乙酸鉛（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司產品；氨水（分析純），廣東西隴化工股份有限公司產品；0.22μm有機系濾膜，天津市津滕實驗設備有限公司產品；試驗用水為Milli-Q超純水，德國默克產品。

1.2 溶液配制

標準貯備液：精密稱取福莫特羅、阿福特羅及福莫特羅-D6對照品適量，用甲醇配制成濃度約為1.00 mg·mL-1的標準貯備液，于2~8℃冷藏保存，有效期為6個月。使用時用0.2%甲酸水溶液逐級稀釋至所需濃度。

鹽酸甲醇提取液：取0.1 mol·L-1鹽酸80 mL，加入甲醇20 mL，混勻。

飽和醋酸鉛溶液：50 mL水中加入適量的醋酸鉛，超聲5 min，直至固體不再溶解。

5%氨水甲醇溶液：量取5 mL氨水，用甲醇稀釋至100 mL。

0.2 %甲酸水溶液：取甲酸1 mL，加水定容至500 mL。

1.3 液相色譜-質譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo scientific BDS Hypersil C18（2.4μm，100 mm×2.1 mm）；流動相為甲醇（A）和0.2%甲酸水溶液（B）；流速：0.3 mL·min-1；進樣體積：4μL；柱溫：30℃；梯度洗脫程序：開始時20%A，3 min 80%A；3.0~5.5 min 80%A；5.6 min 20%A；5.6~10.0 min 20%A。分析總時間為10 min。

1.3.2 質譜條件

離子源：ESI電噴霧離子源；掃描方式：正離子；檢測方式：多反應監測；干燥氣溫度：350℃，流速：10 L·min-1，霧化器壓力：276 kPa，鞘氣流速：11 L·min-1，鞘氣溫度：250℃，毛細管電壓：3.5 kV，碰撞氣體為氮氣。福莫特羅和阿福特羅的質譜參數見表1。

表1 福莫特羅和阿福特羅的質譜參數

1.4 樣品前處理條件

稱取2 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，分別準確加入福莫特羅-D6內標工作液100μL、19 mL鹽酸甲醇提取液和1 mL飽和醋酸鉛溶液，搖勻，充分振蕩20 min，于7 000 r/min離心10 min，取上清液作為備用液。

將固相萃取小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，準確移取5 mL備用液過柱，依次用2 mL水、2 mL甲醇淋洗，真空抽干2 min，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，40℃條件下旋轉蒸發至干或50℃氮吹至干，用1.0 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，過0.22μm濾膜后上機測定。若試樣液中含有的待測物濃度超出線性范圍，進樣前可用一定體積的0.2%甲酸水溶液稀釋，使其濃度在線性范圍內。

2 結果與討論

2.1 樣品提取溶劑和凈化條件的確定

福莫特羅和阿福特羅微溶于水，幾乎不溶于乙腈，溶于甲醇。根據其在不同試劑中的溶解性，試驗分別選取甲醇、鹽酸甲醇、乙酸銨甲醇作為提取溶劑，對添加濃度為1.0 mg·kg-1的乳豬配合飼料樣品進行測定，根據儀器響應值確定最佳提取溶劑。結果表明，使用鹽酸甲醇作為提取溶劑時，回收率最高，色譜峰干擾雜質少，提取液中加入的飽和醋酸鉛能有效沉淀樣品中的蛋白和脂肪，達到了提取和部分凈化的要求。提取液中甲醇比例僅為20%，其價格低廉易得，對操作人員危害小，溶劑更加安全環保。酸性的提取液使堿性待測物呈離子化狀態，既可增強其溶解性，又利于凈化中與萃取柱進行離子交換保留，提高提取回收率。

飼料普遍本底復雜，可能含有動物蛋白、植物蛋白、色素及多種礦物元素。福莫特羅或阿福特羅在配合飼料、濃縮飼料、添加劑預混合飼料中使用劑量不同，因此試驗分別對各類飼料樣品進行了凈化條件的研究。選取實驗室常見的十八烷基硅膠（C18）、混合型陽離子（MCX）、親脂親水性（HLB）固相萃取柱分別考察其對標準物質的保留性以及添加濃度為1.0 mg·kg-1的乳豬配合飼料、豬濃縮飼料、豬復合預混合飼料樣品的回收率。結果表明MCX柱對不同飼料樣品的凈化效果最理想，特別是對于含礦物元素較高的添加劑預混料的回收率較高。由福莫特羅和阿福特羅結構式可知，其屬于弱堿性化合物，MCX混合型陽離子固相萃取柱具有反相和陽離子交換雙重保留性能，對離子化的弱堿性化合物保留能力強，絕對回收率高。因此，本試驗最終選擇MCX萃取柱為凈化柱，結合超高效液相色譜-串聯質譜儀高分離能力、高選擇性、高靈敏度等特點。該方法可適用于實驗室大批量樣品檢測。

2.2 色譜條件的確定

若要分別測定福莫特羅和阿福特羅的含量，首先應將外消旋體分離。目前外消旋體的拆分方法主要有不對稱催化合成、Chiron方法、色譜法等[17]，其中在檢測分析中以色譜法居多，主要通過引入手性環境或將外消旋體轉變為理化性質差異顯著的非對映異構體來實現手性分離[18]。目前色譜法分離對映體主要采用手性色譜柱，固定相主要包括多糖、環糊精、冠醚等[19]，這些固定相與對映體間可能存在靜電、氫鍵、π-π、偶極-偶極等作用，進而實現外消旋體的拆分。手性色譜柱售價一般是普通色譜柱的2~3倍，且流動相的pH值和柱溫對分析結果影響顯著，目前尚無一種普遍適用的手性柱，因此給手性化合物的分離造成極大的困難。福莫特羅和阿福特羅均為國家規定的在養殖環節禁止使用的化合物，因此只要在飼料中檢出兩者中任何一種物質即判定為非法添加物。為使方法具有可操作性和實用性，本試驗選用檢測機構普遍采用的C18色譜柱對福莫特羅和阿福特羅的總量進行測定，極大節約了檢測成本，可實現與β-受體激動劑其他物質的同時檢測。

根據待測物理化性質，分別選用甲醇-水、甲醇-0.2%甲酸水溶液、甲醇-50 mmol·L-1乙酸銨水溶液作流動相，其他條件同“1.3”所述，對質量濃度為20 ng·mL-1的標準品及內標物進行測定，以色譜峰的響應值和分離效果為評判依據，確定最佳流動相比例。結果表明，采用甲醇-0.2%甲酸水溶液作流動相時的信號響應值最高，分離效果滿意，試驗結果與農業行業標準[20]一致。在質譜正離子模式和電噴霧離子源條件下，流動相中添加一定量的甲酸不僅能提高待測物的離子化效率，而且有利于色譜峰形的改善，從而提高方法的靈敏度，因此本方法選其作為流動相。

2.3 定性和定量離子對的確定

在質譜儀正離子模式下，可不安裝色譜柱，直接將液相色譜與質譜用兩通連接，將0.5μg·mL-1的福莫特羅、阿福特羅標準溶液以及福莫特羅內標物分別進行母離子掃描，確定各化合物的分子離子峰，并優化其錐孔電壓。將上述分子離子作為母離子，在碰撞氣體和適當碰撞能量的作用下對其進行子離子全掃描， 選取兩組豐度最高、質荷比大、干擾較小的子離子，將豐度較高的作為定量離子，次之的作為定性離子。將上述母離子和兩組子離子組成監測離子對并進行多反應監測。該監測離子對為待測物的質譜檢測條件，滿足歐盟2002/EC/657對質譜定性4個識別點的指令要求，即1個母離子為1.0個識別點，2個對應的子離子為2×1.5個識別點。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

精密量取適量福莫特羅或阿福特羅標準工作液，用0.2%甲酸水稀釋定容，制得1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng·mL-1各系列工作溶液，內標物濃度均為25 ng·mL-1，供高效液相色譜-串聯質譜測定。以待測物峰面積與其內標物峰面積的比值為縱坐標，以待測物濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明待測物在1.0~100 ng·mL-1濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為y=0.040 8x-0.007 4，相關系數R2=0.999 9。

添加適量標準溶液于空白樣品中，按照1.4和1.3要求進行前處理和測定，依據待測物信噪比S/N>3和S/N>10分別確定方法檢出限（Limit of de?tection，LOD）為0.01 mg·kg-1和定量限（Limit of quantity，LOQ）為0.05 mg·kg-1。本方法定量分析采用內標法校正，消除了樣品基質對測定結果的影響，保證了檢測結果的準確性和實驗操作的重現性。

2.4.2 方法選擇性

豬配合飼料和標準溶液特征離子色譜圖見圖1~圖3。

圖1 空白豬配合飼料特征離子色譜圖

圖3 福莫特羅、阿福特羅及內標物（20 ng·mL-1）特征離子色譜圖

圖2 空白豬配合飼料添加回收（0.5 mg·kg-1）特征離子色譜圖

分別選取豬配合飼料、濃縮飼料、添加劑預混合飼料進行方法定量限濃度添加回收試驗，由試驗結果可知，待測物色譜峰雜質干擾少，響應信號強，滿足測定的要求。

另外，試驗考察了福莫特羅和阿福特羅的同分異構體苯乙醇胺A對測定的干擾[12]，多反應監測色譜圖見圖4。雖然苯乙醇胺A的母離子和其中一個子離子與福莫特羅完全相同，但在現有色譜條件下，兩個化合物實現了完全的分離，苯乙醇胺A不會對福莫特羅的測定結果產生干擾。

圖4 苯乙醇胺A與福莫特羅特征離子色譜圖

2.4.3 回收率與精密度

為進一步考察方法的準確性和精密度，選取空白豬配合飼料和雞配合飼料在0.05、0.10、1.00 mg·kg-1水平下進行加標回收試驗；選取空白豬濃縮飼料和空白雞濃縮飼料分別在0.05、1.00、10.00 mg·kg-1水平下進行加標回收試驗；選取空白豬復合預混料在0.05、1.00、20.0 mg·kg-1水平下進行加標回收試驗。每個添加濃度制備5個平行樣品，重復3個批次，準確度和精密度見表2。結果表明，實際樣品的批內和批間回收率為75.6%~91.4%，批內和批間相對標準偏差均小于9%。說明本方法準確度和精密度良好，符合實驗室質量控制規范要求[19]，適用于各類飼料中福莫特羅和阿福特羅總量的定性和定量檢測。

表2 方法的加標回收率和精密度測定結果

2.5 方法的應用

用本方法對四川省內生產環節和使用環節中的各類飼料產品進行福莫特羅和阿福特羅的測定。地域涵蓋四川省東、西、南、北部8個地級市的飼料生產企業和養殖場戶共計68份樣品，測定結果均是未檢出。原因可能是采集到的飼料中未添加福莫特羅和阿福特羅，但不排除養殖場戶為追求高額利潤，通過其他途徑違規使用，例如飲水、肌肉注射或小范圍拌料。因此，可通過增加監測范圍和樣本數量，擴大采樣途徑，從而更加科學系統地評價飼料中福莫特羅和阿福特羅的風險隱患。

3 結論

本研究利用實驗室普遍采用的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱建立了一種靈敏度、準確度和精密度良好的超高效液相色譜-串聯質譜測定飼料中福莫特羅和阿福特羅總量的方法。樣品提取液有機相含量低，減少了對操作人員的傷害，步驟科學合理，易于操作，使用內標法定量，增強了方法的準確性，為保障飼料及食品質量安全具有重要意義，值得推廣和借鑒。