酸化劑及其衍生物與植物精油復合對常見致病菌體外抑菌效果研究

蘇皓瑀，劉春海，韓建林，陶春衛，李 偉，董秀君

（遼寧菲迪飼料科技有限責任公司，遼寧 興城125100）

酸化劑是一種環保型飼料添加劑，無殘留、無耐藥性、無不良作用，具有抑菌效果，可通過提高消化酶的活性有效降低飼料在消化道中的pH值，從而改善營養物質的消化利用，促進動物生長。尚秀國等[1]研究表明，甲酸、富馬酸等對標準大腸桿菌（ATCC25922）、標準沙門氏菌（ATCC9120）、標準金黃色葡萄球菌（ATCC6538）的抑菌活性強。酸化劑具體分為兩大類，包括H3PO4、HCl及H2SO4等無機酸化劑，以及丁酸、檸檬酸、富馬酸等有機酸化劑。無機酸化劑的添加量難以把控，易損害器械。而有機酸化劑有良好的適口性，且可在體內循環發揮良好作用，因此，有機酸在動物生產中的應用研究日趨普遍[2-6]。

植物精油作為一個潛在的抗生素替代物，可以抑制有害菌的生長繁殖，甚至可直接殺死有害菌，從而達到抗菌作用[7]，同時具有調節腸道菌群結構的作用及提高免疫力、抗氧化等功效[8-11]。因為二者均具有抑菌效果，因此設想二者復合可能效果更佳，故進行試驗以驗證。由于有機酸的作用機理一致，本試驗采用丁酸、月桂酸、辛酸及其衍生物等作為試驗材料，采取二倍稀釋法，研究不同濃度酸化劑及其衍生物與植物精油復合對4種標準菌即致病性大腸埃希氏菌（BNCC 340977）、腸炎沙門氏菌（BNCC 192094）、產氣莢膜梭菌（BNCC 185933）、金黃色葡萄球菌（BNCC 186067）的抑菌效果，從而為其作為抗生素替代品應用于飼料中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 添加劑

植物精油（商品名為凈力安Ⅳ），主要成分有香芹酚、百里香酚、肉桂醛；酸化劑及其衍生物（辛酸、單辛酸甘油酯、月桂酸、單月桂酸甘油酯、丁酸和苯甲酸），樣品濃度為100 mg·mL-1，遼寧菲迪飼料科技有限責任公司提供。

1.2 試驗菌種

致病性大腸埃希氏菌（BNCC 340977）、腸炎沙門氏菌（BNCC 192094）、產氣莢膜梭菌（BNCC 185933）、金黃色葡萄球菌（BNCC 186067），均購買自北京北納創聯生物技術研究院。

1.3 主要儀器和培養基

高溫滅菌鍋（型號為BXM-30R）、恒溫培養箱（型號為SPX-250B-Z）、超凈工作臺（型號為SWCJ-2FD）、厭氧培養箱等（型號為HYQX-I）；營養肉湯、營養瓊脂、液體硫乙酸鹽培養基，均購買自北京北納創聯生物技術研究院。

1.4 菌懸液的制備

取凍存的菌種，接種于裝有50 mL營養肉湯液體培養基的三角瓶中，置于37℃搖床中振蕩培養18~24 h；取凍存的菌種，接種于裝有50 mL液體硫乙醇酸鹽培養基的三角瓶中，置于37℃搖床中振蕩培養18~24 h。采用平板菌落計數法測定細菌數量，制成1×107~1×108cfu·mL-1的菌懸液。

1.5 最小抑菌濃度（MIC）測定

采用二倍稀釋法測定不同濃度酸化劑及其衍生物與植物精油復合對常見菌種的MIC，每個菌種做4組平行。

取11只滅菌試管，按順序編號，在第1管中加入1.6 mL營養肉湯培養基，其余各管均加入1.0 mL。然后在各個試管中加入添加劑復合物。第1管加入添加劑0.4 mL，混勻后吸出1.0 mL加入到第2管中。同樣的方法依次稀釋至第11管，棄去1.0 mL，第11管為生長對照組。第1管濃度為10 000μg·mL-1，第2管濃度為5 000μg·mL-1，第3管的濃度為2 500μg·mL-1，以此類推。在第11管中加入0.4 mL乙醇，充分混合后加入1.0 mL菌懸液。用已滅菌的橡膠塞塞住試管口，置于37℃培養箱中培養。

培養24 h后觀察各試管的渾濁度，以試管中的培養液出現渾濁為有細菌生長的標志，即以某編號試管以下不再發生明顯混濁現象，這一試管的樣品濃度為該樣品對細菌的MIC。

2 結果與分析

2.1 植物精油與辛酸復合物的抑菌效果

測定植物精油與辛酸不同質量比復合時的MIC，結果見表1。

表1 植物精油與辛酸復合對四種常見菌的MICμg·mL-1

由表1可知，植物精油與辛酸質量比為1∶5時對致病性大腸埃希氏菌、產氣莢膜梭菌的MIC為156.250、78.125μg·mL-1。當植物精油質量一定時，隨著辛酸質量的增加，對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌的抑菌效果隨之升高，但不會一直升高，在植物精油與辛酸質量比為1∶3時效果最好。

2.2 植物精油與單辛酸甘油酯復合的抑菌效果

測定植物精油與單辛酸甘油酯不同質量比復合時的MIC，結果見表2。

表2 植物精油與單辛酸甘油酯復合對四種菌的MICμg·mL-1

由表2可知，植物精油對四種菌的MIC均為312.500μg·mL-1。在植物精油與單辛酸甘油酯質量比為1∶5時對金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌的抑菌效果最好。

對腸炎沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的抑菌效果不會隨單辛酸甘油酯質量的增加而升高，在植物精油與單辛酸甘油酯質量比為1∶3時對腸炎沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的抑菌效果最好，MIC分別為156.250、19.530μg·mL-1。

2.3 植物精油與月桂酸復合的抑菌效果

測定植物精油與月桂酸不同質量比復合時的MIC，結果見表3。

表3 植物精油與月桂酸復合對四種菌的MICμg·mL-1

由表3可知，即植物精油∶月桂酸為1∶0時，植物精油對四種菌的MIC均為312.500μg·mL-1，植物精油與月桂酸1∶1復合時，對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌的MIC分別為39.062、312.500μg·mL-1；當植物精油質量一定時，隨著月桂酸質量的增加，抑菌效果并沒有隨之增加。植物精油與月桂酸按質量比1∶3復合時，對致病性大腸埃希氏菌、產氣莢膜梭菌的MIC分別為39.062、9.765μg·mL-1，效果較好。

2.4 植物精油與單月桂酸甘油酯復合的抑菌效果

測定植物精油與單月桂酸甘油酯不同質量比復合時的MIC，結果見表4。

表4 植物精油與單月桂酸甘油酯復合對四種菌的MICμg·mL-1

由表4可知，植物精油與單月桂酸甘油酯質量比為1∶3、1∶5時對金黃色葡萄球菌、致病性大腸埃希氏菌的抑菌效果相同，植物精油與單月桂酸甘油酯質量比為1∶1、1∶3時對產氣莢膜梭菌的抑菌效果相同，單月桂酸甘油酯對腸炎沙門氏菌的抑菌效果并不明顯。植物精油與單月桂酸甘油酯復合對金黃色葡萄球菌的MIC為19.530μg·mL-1，對致病性大腸埃希氏菌的MIC為39.062μg·mL-1，對產氣莢膜梭菌的MIC為4.88μg·mL-1。

2.5 植物精油與丁酸復合的抑菌效果

測定植物精油與丁酸不同質量比復合時的MIC，結果見表5。

表5 植物精油與丁酸復合對四種菌的MICμg·mL-1

由表5可知，植物精油與丁酸復合對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌的抑菌效果并不明顯，抑菌效果并不隨著植物精油與丁酸的質量比增加而增加，植物精油與丁酸質量比為1∶2時對致病性大腸桿菌、產氣莢膜梭菌的MIC為156.250μg·mL-1。

2.6 植物精油與苯甲酸復合的抑菌效果

測定植物精油與苯甲酸不同質量比復合時的MIC，結果見表6。

表6 植物精油與苯甲酸復合對四種菌的MICμg·mL-1

由表6可知，植物精油與苯甲酸的質量比為1∶0、1∶2時對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、致病性大腸埃希氏菌的抑菌效果相同，因此說苯甲酸對三種菌的抑菌效果并不明顯。植物精油與苯甲酸在質量比為1∶2時對產氣莢膜梭菌的抑菌效果最好，MIC達156.250μg·mL-1。

3 討論與結論

3.1 單一植物精油與單一酸化劑的抑菌效果

單一植物精油具有抑菌效果，已經被證實。王康莉等[7]的檢測結果表明，肉桂醛對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌有抑制作用，其MIC為1 560μg·mL-1，百里香酚對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的MIC為1 560、3 130、1 560μg·mL-1。而韓乾杰等[10]也證實肉桂醛、百里香酚對產氣莢膜梭菌具有抑菌效果。甲酸、富馬酸等對標準大腸桿菌、標準沙門氏桿菌、標準金黃色葡萄球菌的抑菌活性較強[1]。

3.2 復合植物精油的抑菌效果

根據前人試驗結果，筆者認為酸化劑復合植物精油具有協同作用，由試驗結果得知，復合植物精油對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、致病性大腸埃希氏菌、產氣莢膜梭菌的最小抑菌濃度為312.500μg·mL-1，由此可知，酸化劑與植物精油之間存在協同作用。

3.3 植物精油和酸化劑復合的抑菌效果

植物精油與辛酸、單辛酸甘油酯、月桂酸、單月桂酸甘油酯組成的復合植物精油對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、致病性大腸埃希氏菌、產氣莢膜梭菌的抑菌效果比單獨的植物精油更強，而植物精油與苯甲酸的復合對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、致病性大腸埃希氏菌的抑菌效果并不明顯，植物精油與丁酸復合對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌抑菌效果并不明顯。