加壓提取馬齒莧抗氧化成分工藝優化

朱慶書,耿逸婉,肖 薇,鄭文迪,趙文英

(青島科技大學 化工學院,山東 青島 266042)

馬齒莧為馬齒莧科一年生草本植物的全草,是一種常見的藥食兩用性植物。近代研究表明[1-2],馬齒莧具有抗炎、降血脂、降血糖、抗衰老等藥理作用,這與其具有很強的抗氧化活性有關。如BEHRAVAN 等[3]研究表明,馬齒莧水提物和乙醇提取物對H2O2人淋巴細胞DNA 損傷有保護作用;蘇銳等[4]對馬齒莧成分進行提取,發現其對羥自由基的清除率達68.33%,對超氧陰離子的清除作用達82.26%,對油脂也表現出較強的抗氧化作用。其他學者研究結果[5-6]也提示,馬齒莧具有較強的抗氧化活性,有望成為新一代天然抗氧化劑。

為提高馬齒莧抗氧活性成分提取效率,更好的發揮馬齒莧的臨床應用價值,本研究采用加壓提取技術提取馬齒莧中抗氧化活性成分,并對其提取工藝進行優化,為更好地開發馬齒莧中的抗氧化活性成分提供物質支持和實驗依據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

馬齒莧(Portulaca oleracea L.),青島市京城百草廳藥房;DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼),美國Sigma公司;乙酸乙酯,天津市廣成化學試劑有限公司;正丁醇,天津市富宇精細化工有限公司。

紫外可見分光光度計,UV-6000 型,上海元析儀器有限公司;加壓提取裝置,實驗室自制;旋轉蒸發儀,RE-52型,上海亞榮生化儀器廠;循環水多用真空泵,河南鞏義市峪予華儀器廠。

1.2 馬齒莧加壓提取

將藥材馬齒莧用粉碎機粉碎,稱取10.0 g馬齒莧樣品,裝入藥品布袋中,將布袋置于加壓提取裝置中,根據設定的料液比加入對應量的去離子水,設置加壓溫度和壓力后將加壓提取裝置進行密封,當溫度到達設定溫度時開始計時,達到提取時間后關閉加壓裝置,停止加熱并泄壓,開罐取出提取液,并趁熱過濾。

利用單因素實驗法,在提取壓力0.5 MPa條件下,考察溫度、料液比和時間對提取浸膏得率和抗氧化活性的影響。

1.3 馬齒莧提取物不同極性部位的制備

將濾液旋蒸濃縮至50 m L,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取2次,得到4種不同部位的提取物,各部位提取物置于蒸發皿中揮干溶劑,制成浸膏,備用。

1.4 馬齒莧提取物DPPH 自由基清除率的測定

稱取待測物樣品適量,用甲醇溶解,配成0.1 mg·m L－1的樣品溶液,置于陰涼處保存備用。取1.0 m L樣品溶液按常規方法[7]測定抗氧化活性。

1.5 多指標綜合評分的計算

各部位綜合評分以該部位提取物的浸膏量及其DPPH 自由基清除率為考察指標,根據文獻[8]及本實驗目的,確定指標的優先順序為DPPH 自由基清除率＞浸膏量。將DPPH 自由基清除率的權重系數設為0.7,浸膏量的權重系數設為0.3,計算各部位綜合評分。

2 結果與討論

2.1 馬齒莧抗氧化活性部分確定

提取溫度130 ℃、料液比1∶30、提取時間30 min、壓力0.5 MPa的條件下提取得到的馬齒莧提取物,分離為不同極性部位并配置成0.1 mg·m L－1樣品溶液,為與文獻[7]作比較,取1.4 m L 進行DPPH 自由基清除實驗的測定,實驗結果見表1。

表1 馬齒莧不同極性部位提取物的DPPH·清除率Table 1 DPPH·clearance rate of extracts from different polarity positions of Portulaca oleracea L.

表1 顯示馬齒莧不同極性部位提取物對DPPH·清除能力存在一定差別。乙酸乙酯層與正丁醇層提取物對DPPH 自由基有較強的清除效果,而石油醚層與水層提取物的抗氧化活性相對較弱,可見馬齒莧中的主要抗氧化活性成分的極性為中等極性和較大極性。根據極性推測,主要抗氧化活性成分可能是馬齒莧中含有的中等極性的二萜、生物堿、黃酮苷元等化合物,以及較大極性的含糖基的皂苷類化合物,如甾體皂苷、三萜皂苷和黃酮苷等。馬齒莧各個部位提取物對DPPH·的清除率大小與文獻[7]趨勢基本一致。楊子娟[9]通過DPPH 自由基活性清除實驗和抑制脂質過氧化實驗測定也發現,馬齒莧主要抗氧化活性成分集中于乙酸乙酯層和正丁醇層。相比較于提取時間長、需多次提取的傳統回流提取法[7,9],加壓提取法具有提取時間短,提取效率高的優勢。而且從目前國外研究報道來看,加壓提取技術也有逐漸取代傳統提取技術用于多糖[10]、多酚[11]等各類抗氧化成分提取的趨勢。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取溫度的影響

在液料比30∶1、提取時間30 min、壓力0.5 MPa的條件下,考察提取溫度對馬齒莧提取物的浸膏量和抗氧化活性的影響,結果見表2。

表2 提取溫度對結果的影響Table 2 Influence of extraction temperature on the results

升溫可使有效成分擴散速率加快,有利于浸膏產率的提高,但溫度過高,生物質會發生美拉德反應,使提取液顏色加深,且可能造成熱敏性物質被破壞而使有效成分提取率降低。由表2 可知,乙酸乙酯層和正丁醇層浸膏量分別在110和100 ℃時達到最大,但清除率都呈現出隨著溫度升高而增加的趨勢,這可能與溫度升高促進生物質發生美拉德反應有關,根據文獻[12]報道,美拉德反應產物通常具有較高的抗氧化活性。根據各層綜合評分,乙酸乙酯層最佳提取溫度為110 ℃,正丁醇層為130 ℃,若綜合考慮兩部位,則最佳的提取溫度為130 ℃。

2.2.2 料液比的影響

提取溫度130 ℃、提取時間30 min、壓力0.5 MPa的條件下,考察不同料液比對提取物浸膏量和抗氧化活性的影響,結果見表3。

表3 料液比對結果的影響Table 3 Influence of solid-liquid ratio on the results

表3總體趨勢表現為乙酸乙酯層浸膏量少,DPPH·清除率高,而正丁醇層浸膏含量高,清除率低。具體分析,當溶劑倍量從15倍上升至40倍時,乙酸乙酯層和正丁醇層的浸膏量都是先降低然后再升高;但乙酸乙酯層提取物的DPPH·清除率逐漸降低,而正丁醇層浸膏的DPPH·清除率卻呈逐步升高的趨勢,浸膏提取率的變化與DPPH·清除率的變化并不一致。總體來看,料液比的增加有利于浸膏量的增加,但會影響乙酸乙酯層的抗氧化作用,并且大量溶劑的使用造成回收麻煩、耗能大、浪費多;而料液比過小,會影響正丁醇層提取物的清除率。經綜合評分,乙酸乙酯層最適宜料液比為1∶15,正丁醇層最適宜液料比為30∶1,若綜合考慮兩部位,則最佳液料比為30∶1。

2.2.3 提取時間的影響

提取溫度130 ℃、液料比30∶1、壓力0.5 MPa的條件下,考察不同提取時間對提取效果的影響,結果見表4。

表4 提取時間對結果的影響Table 4 Influence of extraction time on the results

適宜的提取時間對提取藥材中的有效成分十分重要,時間過短,成分無法浸出完全;而時間過長又會造成資源的浪費,降低生產效率。由表4可知,延長時間,兩個部位的浸膏含量都逐漸增加,而DPPH清除率呈現先升高再降低的趨勢,30 min時,兩個部位提取物的清除率皆較高,分別為76.77%,49.62%。經綜合評分,乙酸乙酯層和正丁醇層的最佳提取時間皆為30 min。

2.3 響應面優化

2.3.1 星點試驗設計與結果

在單因素試驗的基礎上,根據中心組合設計原則,選擇提取溫度、液料比和提取時間作為考察因素,每個因素設計5 水平,用代碼－α,－1,0,1,α(α＝1.682)來表示,代碼所表示的實際操作物理量見表5。

表5 馬齒莧提取工藝星點試驗因素水平Table 5 Star test factor levels of Portulaca oleracea L.extraction process

根據表6試驗安排,進行三因素五水平試驗,結果如下。綜合評分為因變量,其評分越高,表示所在工藝越好。

表6 馬齒莧提取工藝星點試驗設計與結果Table 6 Experimental design and results of Portulaca oleracea L.extraction process

2.3.2 模型擬合與顯著性檢驗

利用軟件Design-Expert 8.0.6對表6的數據進行多項式回歸分析[13],建立馬齒莧抗氧化活性部位提取工藝參數回歸模型,得到乙酸乙酯層回歸方程公式:綜合評分＝91.74＋5.81×A－0.44×B＋1.83×C－2.36×AB＋2.30×AC－1.49×BC－4.31×A2－3.35×B2－2.48×C2。決定系數R2為0.970 8,校正決定系數R2Adj為0.944 5,說明模型與數據擬合度高,可信度好,預測性好。

正丁醇層回歸方程公式:綜合評分＝85.17＋3.17×A＋0.77×B＋0.57×C－0.079×AB－0.63×AC－0.031×BC－2.45×A2－1.73×B2－1.52×C2。決定系數R2為0.928 0,校正決定系數R2Adj為0.863 2,說明模型的復相關系數R 值較高,說明模型與數據擬合度較好。

2.3.3 響應面優化及預測

響應面圖可以用于預測和檢驗變量的響應值,以及確定變量之間的相互關系。溫度、液料比和時間對乙酸乙酯層綜合評分影響的等高線圖和響應面圖見圖1。

圖1 溫度、液料比和時間對乙酸乙酯層綜合評分的影響的等高線圖、響應面圖Fig.1 Contour plot and response surface plot of the influence of temperature,liquid-solid ratio and time on the comprehensive score of ethyl acetate layer

由圖1可知,乙酸乙酯層B(液料比)和C(提取時間)兩因素的交互作用較明顯。利用Optimization功能,預測得到乙酸乙酯層最佳提取工藝條件:提取溫度為133℃,液料比為29∶1,提取時間為32 min,綜合評分為94.71。

溫度、液料比和時間對正丁醇層綜合評分影響的等高線圖和響應面圖見圖2。由圖2可知,正丁醇層提取A(提取溫度)和C(提取時間)兩因素的交互作用較明顯。利用Optimization功能,預測得到正丁醇層最佳提取工藝條件:提取溫度為134℃,液料比為31∶1,提取時間為30 min,綜合評分為86.28。

圖2 溫度、液料比和時間對正丁醇層綜合評分的影響的等高線圖、響應面圖Fig.2 Contour map and response surface map of the influence of temperature,liquid-solid ratio and time on the comprehensive score of n-butanol layer

2.3.4 驗證試驗

由于提取設備精度限制,對于乙酸乙酯層,設定溫度為133 ℃,料液比為29∶1,提取時間為32 min,進行最佳工藝的驗證試驗,平行試驗3次。實際測得的綜合評分均值為91.26,和預測值94.71的偏差為3.64%。

對于正丁醇層,設定溫度為134 ℃,料液比為31∶1,提取時間為30 min,平行試驗3次,實際測得的綜合評分均值為86.26,和預測值86.28的偏差為0.02%。

3 結 論

采用加壓溶劑提取法提取馬齒莧乙酸乙酯和正丁醇層的抗氧化活性成分,并對其提取工藝進行優化,得到加壓提取的最佳提取工藝條件:對乙酸乙酯層,提取溫度133 ℃,液料比29∶1,提取時間32 min;對正丁醇層,提取溫度134 ℃,液料比31∶1,提取時間30 min。最終實驗結果表明:兩個活性部位的提取物極性雖然有差別,但提取工藝條件相差不大,這可能與加壓溶劑提取技術特有的能夠使提取溶劑溶解能力增強、溶解范圍增大有關。