大鼠感染泡球蚴后外周血及脾臟中濾泡輔助T淋巴細(xì)胞的變化

張耀剛，李建華，侯 靜，孫 莉，田美媛，江 源，黃登亮，張 濤,3，馬艷艷，樊海寧

1 青海大學(xué)附屬醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，西寧 810000；2 青海省包蟲病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810000；3 青海大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，西寧 810000

多房棘球絳蟲的幼蟲期是泡型包蟲病(aveolar echinococcosis,AE)的病原體，是一種分布在北半球的寄生性人畜共患疾病，估計(jì)每年有17 400例新感染[1-2]。在全球每年AE新發(fā)病例中，91%發(fā)生在中國(guó)，某些地區(qū)的人類流行率超過(guò)3%[3]。在泡球蚴慢性感染過(guò)程中，最初的急性炎癥Th1反應(yīng)逐漸轉(zhuǎn)化為混合Th1/Th2反應(yīng)[4]。但這種相對(duì)簡(jiǎn)單的Th1-Th2轉(zhuǎn)變模式已經(jīng)被新的研究不斷修改，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其他T淋巴細(xì)胞的亞群也參與到泡球蚴慢性感染過(guò)程，如CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴(Treg)細(xì)胞和Th17細(xì)胞作為Th1和Th2細(xì)胞的兩個(gè)不同亞群，它們似乎在AE的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用[4-5]。新近的報(bào)道發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞還有一個(gè)獨(dú)特的亞群，就是濾泡輔助T淋巴細(xì)胞(Tfh)，在調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞依賴性B淋巴細(xì)胞反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。這類特殊的輔助性T淋巴細(xì)胞定位于生發(fā)中心，其高表達(dá)CXCR5、ICOS(inducible T-cell costimulator)、PD-1(programmed death-1)、CD200、BTLA(B-and T-lymphocyte attenuator)等表面受體，以及細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl6[6]。生發(fā)中心的形成、B淋巴細(xì)胞的分化和抗體親和力成熟過(guò)程都離不開Tfh的輔助作用。泡球蚴在宿主內(nèi)的免疫逃避機(jī)制是否與Tfh細(xì)胞有關(guān)，是很值得探討的問(wèn)題，因此，本研究初步觀察了多房棘球蚴在AE動(dòng)物模型中的表達(dá)，以了解泡球蚴感染與Tfh細(xì)胞的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～10周齡SD雄性大鼠購(gòu)買于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCJX(蘇)2017-0001；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)SYXK(青)2016-0001：動(dòng)物合格證號(hào)：2019186104。用于泡球蚴保種的蒙古長(zhǎng)爪沙鼠來(lái)源于青海省包蟲病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器試劑 BD FACSCelest流式細(xì)胞儀，CoraLite?647-Conjugated PD-1(Proteintech，CL647-66220)，Anti-CXCR5抗體 (Alexa Fluor?488)(ABcam,ab223980)，Mouse Anti-Rat CD4(BD,551397)，Lysing Buffer(BD,555899)。

1.3 動(dòng)物造模 將1只成功感染泡球蚴的長(zhǎng)爪沙鼠斷頸處死后分離原頭節(jié)，使用0.04%臺(tái)盼藍(lán)檢查原頭節(jié)活性。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組，每組10只。對(duì)照組不做任何處理，模型組用10%水合氯醛0.3 ml/100 g麻醉,碘伏消毒上腹部皮膚,開腹約0.5 cm，直視下7 號(hào)針頭右肝葉穿刺，注入泡球蚴混懸液(約2000個(gè)具有活性的原頭節(jié))，然后用可吸收手術(shù)縫合線縫合腹部肌肉及皮膚。3個(gè)月后，用10%水合氯醛0.3 ml/100 g 麻醉SD大鼠后，開腹暴露下腔靜脈，用含EDTA-K2的采血管保存血液。斷頸處死后分離脾臟。

1.4 脾臟單細(xì)胞懸液的制備 稱取0.1 g的脾臟組織，在300目的鋼網(wǎng)上研磨，鋼網(wǎng)下放置35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿收集細(xì)胞，邊研磨邊用HBSS緩沖液沖洗，將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的液體用300目的鋼網(wǎng)在過(guò)濾一次后，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中?；靹蚝箪o置5 min。將最上層2 ml去掉，吸取1 ml細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中，1000 r/min 離心5 min，小心吸掉上清。加入1 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后，冰上靜置15 min，1000 r/min 離心5 min，小心吸掉上清，加入1 ml HBSS緩沖液懸浮細(xì)胞后，450 g/min 離心5 min，吸掉上清，加入1 ml HBSS緩沖液懸浮細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。每個(gè)流式管分裝1×106個(gè)細(xì)胞。用HBSS緩沖液將體積定容為100 μl。

1.5 PBMC細(xì)胞懸液的制備及熒光抗體孵育 依照血常規(guī)結(jié)果，計(jì)算每個(gè)檢測(cè)管WBC的數(shù)目為1×106個(gè)細(xì)胞，將血液分裝于流式檢測(cè)管中，每組設(shè)置blank管和三色熒光標(biāo)記管，以CD4+CXCR5+PD1+為Tfh細(xì)胞的標(biāo)記。每管加入CD4-PE 5 μl，CXCR5-488 2 μl，PD1-Alexa Fluor 647 1 μl，旋渦混勻，室溫避光孵育20 min，加入1 ml紅細(xì)胞裂解液，旋渦混勻冰上靜置15 min，1000 rpm/min 離心5 min，小心吸掉上清，加入1 ml HBSS緩沖液懸浮細(xì)胞后，450 g/min離心5 min，吸掉上清，重復(fù)3次，洗去紅細(xì)胞，加入300 μl HBSS緩沖液懸浮細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。脾臟細(xì)胞熒光抗體孵育步驟與PBMC細(xì)胞類似。

1.6 倫理學(xué)審查 本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按照青海大學(xué)附屬醫(yī)院科研倫理委員會(huì)的指導(dǎo)原則接受人道護(hù)理，動(dòng)物操作規(guī)程經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：P-SL-2019033。所有手術(shù)均在水合氯醛麻醉下進(jìn)行，并盡一切努力減少痛苦。

2 結(jié)果

2.1 模型建造情況 造模3個(gè)月后，大鼠肝臟上長(zhǎng)出明顯病灶(圖1a)，病灶中可見(jiàn)較多原頭節(jié)(圖1b)。

注：a,感染多房棘球蚴3個(gè)月后，SD大鼠肝臟病灶情況；b,病灶HE染色結(jié)果(×100)。圖1 模型建造情況

2.2 Tfh細(xì)胞在AE模型鼠外周血中的表達(dá)情況 感染泡球蚴3個(gè)月后，模型組大鼠外周血中CD4+CXCR5+PD1+Tfh細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的平均占比相較于正常對(duì)照組明顯升高(t=10.230，P<0.001)，在所有細(xì)胞中CD4+CXCR5+PD1+Tfh細(xì)胞所占的比例低于正常對(duì)照組(t=5.520，P<0.001)(表1,圖2)。

表1 AE模型鼠外周血中Tfh細(xì)胞表達(dá)情況

注：空白組，未標(biāo)記熒光抗體用于流式細(xì)胞術(shù)圈門設(shè)定界限的組；a、d、g,外周血中淋巴細(xì)胞；b、e、h,CD4+細(xì)胞；c、f、i，CD4+中CXCR5和PD1陽(yáng)性細(xì)胞，其中Q2門表示CD4+CXCR5+PD1+Tfh細(xì)胞。圖2 AE模型鼠外周血中Tfh細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

2.3 Tfh細(xì)胞在AE大鼠模型脾臟中的表達(dá)情況 感染泡球蚴3個(gè)月后，模型鼠脾臟中Tfh細(xì)胞在所有細(xì)胞中百分比高于正常對(duì)照組(t=4.769，P<0.001)(表2,圖3 )。

表2 AE模型鼠脾臟中Tfh細(xì)胞表達(dá)情況

注：a、d、g,目的細(xì)胞群；b、e、h,CD4+細(xì)胞；c、f、i,CD4+中CXCR5和PD1陽(yáng)性細(xì)胞,其中Q2門表示CD4+CXCR5+PD1+Tfh細(xì)胞。圖3 AE模型鼠脾臟中Tfh細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

3 討論

盡管Tfh的功能早在1980年就已眾所周知，但直到2009年人們才認(rèn)識(shí)到其屬于CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，最早在人的扁桃體中被發(fā)現(xiàn)。它們?cè)诒Ｗo(hù)性免疫中起關(guān)鍵作用，協(xié)助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)外源病原體的抗體。Tfh細(xì)胞位于次級(jí)淋巴器官，包括扁桃體、脾臟和淋巴結(jié)，與B淋巴細(xì)胞緊密互動(dòng)[7-9]。除此之外，在循環(huán)系統(tǒng)中也可以發(fā)現(xiàn)Tfh細(xì)胞。Tfh細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的建立以及功能的完善非常重要，特別是針對(duì)感染疾病的體液免疫起決定性調(diào)節(jié)作用，同時(shí)在自身免疫和腫瘤發(fā)生等相關(guān)疾病中也扮演重要角色。其特殊之處在于，它沒(méi)有溶解細(xì)胞或吞噬細(xì)胞的作用，但卻可以激活并指導(dǎo)其他免疫細(xì)胞[10]。

在許多抗體產(chǎn)生過(guò)多或不足的疾病中，Tfh功能已顯示出功能失調(diào)。血液循環(huán)中的Tfh細(xì)胞數(shù)已表明自身免疫性疾病(包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)患者血液中Tfh數(shù)量的增加。由ICOS缺乏引起的常見(jiàn)免疫缺陷患者已出現(xiàn)循環(huán)Tfh嚴(yán)重降低和抗體生成方面的缺陷[11-13]。如目前發(fā)現(xiàn)在HIV感染中Tfh細(xì)胞功能可能存在缺陷。研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，HIV患者Tfh細(xì)胞明顯增多，體內(nèi)廣譜中和性抗體量卻極少，并且從HIV感染患者體內(nèi)分離的Tfh細(xì)胞，其IL-21的分泌明顯減少，無(wú)法給予B淋巴細(xì)胞所需信號(hào)，說(shuō)明 HIV患者的Tfh存有極大缺陷[16-17]。

最近的證據(jù)[18]表明，瘧原蟲感染能夠使CD4+T淋巴細(xì)胞偏向于向主要產(chǎn)生IFNγ的Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)變，從而影響Tfh細(xì)胞的分化，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞對(duì)瘧原蟲反應(yīng)降低。泡球蚴進(jìn)入宿主機(jī)體后會(huì)引起復(fù)雜的免疫反應(yīng)，最終引起免疫逃避。首先參與抗蟲免疫的是固有免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，但樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞不是泡球蚴實(shí)現(xiàn)免疫逃避調(diào)節(jié)期功能的唯一目標(biāo)。內(nèi)皮細(xì)胞(在皮膚、肺、腸和肝中)也可以被誘導(dǎo)表達(dá)和分泌抗炎介質(zhì)，如IL-10和前列腺素[19]。這樣，寄生蟲不僅減少了被消滅的可能性，還能最大限度地減少局部宿主組織的損傷。通過(guò)誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能變化，進(jìn)而引起T淋巴細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)變[4]。

泡球蚴與棘球蚴具有較高的同源性，但感染機(jī)體后引起機(jī)體的反應(yīng)卻存在較大差異，棘球蚴感染人體后可被宿主產(chǎn)生的纖維外囊包裹，而泡球蚴感染宿主后呈侵潤(rùn)性生長(zhǎng)[20-21]。泡球蚴感染早期引起的宿主免疫應(yīng)答以Th1類為主，3個(gè)月后則轉(zhuǎn)為以Th2類為主[5]。丁劍兵教授團(tuán)隊(duì)[22]研究細(xì)粒棘球蚴患者術(shù)前術(shù)后外周血Tfh細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，囊型包蟲病患者術(shù)前外周血中Tfh細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，且術(shù)后Tfh細(xì)胞明顯下降，提示Tfh細(xì)胞參與了棘球蚴的感染。本研究也發(fā)現(xiàn)泡球蚴感染SD大鼠3個(gè)月之后，外周血Tfh細(xì)胞較正常組明顯升高。但Tfh細(xì)胞在脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞中所占比例并沒(méi)有升高，并且無(wú)論是外周血還是脾臟中，泡球蚴感染后Tfh細(xì)胞在單個(gè)核細(xì)胞或脾臟細(xì)胞中的百分比是降低的，提示泡球蚴感染3個(gè)月后，宿主免疫細(xì)胞可能減少。

本研究初步研究了Tfh細(xì)胞在泡球蚴感染后的變化，今后將進(jìn)一步深入動(dòng)態(tài)的分析Tfh細(xì)胞在泡球蚴感染引起宿主免疫功能調(diào)節(jié)，以適應(yīng)自身生存中的作用，為揭示泡球蚴在宿主體內(nèi)的免疫逃避機(jī)制提供參考。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：馬艷艷、樊海寧負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，擬定寫作思路；張耀剛、李建華負(fù)責(zé)資料分析，撰寫論文；侯靜、孫莉、田美媛、江源、張濤、黃登亮參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；馬艷艷、樊海寧指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。