糞大腸菌群（MPN法）測定結果的評價方法比較

王寵 吳旸 孫開爭 郭萌萌 徐國棟 張水燕

摘要：目的：探索8家實驗室糞大腸菌群（MPN法）檢測結果的一種評價方法。方法：采用Grubbs檢驗法、泊松分布置信區間法和改進的En值法分別評價了檢測結果，結合“不合格”或“不滿意”實驗室問題追蹤結果，比較了3種方法的評價結論。結果：較其他2種方法，改進的En值評價方法不但考慮了標準定量菌株和MPN方法的不確定度，而且還考慮了其分布特點，其評價結論更符合實際情況，更加科學合理。結論：改進的En值評價方法適用于MPN法的準確度評價，不僅可以評價能力驗證或能力考核結果，而且還可以評價日常質控樣品的準確度。

關鍵詞：糞大腸菌群;MPN;En值

中圖分類號：X820.3? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：2095-672X（2021）01-0072-06

DOI.10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2021.01.011

Comparison of evaluation methods for the determination of fecal coliform （MPN）

Wang Chong ，Wu Yang，Sun Kaizheng，Guo Mengmeng，Xu Guodong，Zhang Shuiyan

（Ji'nan Eco-environmental Monitoring Center of Shandong Province， Ji'nan Shandong 250101，China）

Abstract：Objective：Explore an evaluation method of fecal coliform （MPN） detection results of 8 laboratories.Method：Grubbs test method， Poisson distribution confidence interval method and improved en value method were used to evaluate the test results. Combined with the "unqualified" or "Unsatisfactory" laboratory problem tracking results， the evaluation conclusions of the three methods were compared.Result ：Compared with the other two methods， the improved en value evaluation method considered not only the uncertainty of standard quantitative strains and MPN method， but also their distribution characteristics. The evaluation conclusion is more in line with the actual situation and more scientific and reasonable.Conclusion：This method was suitable for the accuracy evaluation of MPN method， which can not only evaluate the ability verification or ability examination results， but also evaluate the accuracy of routine quality control samples.

Key words：Fecal coliform;most probable numbers; MPN;En value

最大可能數（MPN）法[1-5]很早就應用于總大腸菌群和糞大腸菌群等微生物指標分析。該方法是生態環境監測領域多管發酵法[6]和酶底物法[7]的理論基礎，也在衛生檢驗、食品檢驗領域獲得了廣泛應用。該方法不同于平板計數法用菌落數量直觀表示測量結果，而是通過概率理論估算細菌濃度的一種方法，同時給出檢測結果的置信區間，可以是95%概率（包含因子k=2）和99%概率（包含因子k=3），因為MPN值本身的不確定度是MPN法檢測結果不確定度的主要來源，因此可以忽略其他顯著小的不確定度，該置信區間可以作為MPN值的擴展不確定度[8]使用。該不確定度的分布與常見的正態、三角型、梯形、矩形等對稱分布不同，它屬于不對稱分布，多管發酵法MPN值的置信區間形狀類似于色譜分析中的拖尾峰，表現為MPN值與置信區間下限的差值小，而與置信區間上限的差值大。

糞大腸菌群直接來源于糞便，被廣泛應用為衡量水體糞便污染的指示微生物，水體存在糞大腸菌群表明水體已被糞便污染，該項目是地表水環境質量標準、污水綜合排放標準等各類標準的監測指標。多管發酵法是傳統的糞大腸菌群檢測方法，因具有不受濁度影響， 可以檢驗濁度較大水樣， 價格便宜等優點，被廣泛使用。本單位組織8家實驗室開展了糞大腸菌群（MPN法）能力考核，然而，常用的統計方法如穩健統計方法[9]、改進的經典統計法[10]和En值法[9，11]等均無法完成結果評價。如穩健統計方法主要適用于15家以上實驗室參加的能力驗證/能力考核的結果評價;改進的經典統計法雖然適用于10家左右的實驗室參加的能力驗證/考核結果評價，但一般適用于有精密度限值的化學分析項目;En值法[9，11]主要適用于不確定度屬于對稱分布的結果評價，該方法使用時需實驗室提供測量結果的不確定度和指定值的不確定度，適用于1家實驗室參加的測量審核。而本次能力考核用的定量標準菌株的不確定度為對稱分布，糞大腸菌群（MPN法）檢測結果的不確定度為不對稱分布，因此，En值法也無法評價結果。針對這種情況提出了改進的En值方法，并與Grubbs檢驗法[12]、泊松分布置信區間法[13]進行了比較。

1? ? 能力考核

1.1? ? 考核菌株

定量標準菌株：大腸桿菌（ Escherichia coli NCTC 12241，Bioball single shot，Lot Number：B2976， BTF-A biomerieux Company Sydney Australia），標準值為31.1±5.2cfu（包含因子k=2）。

1.2? ? 考核樣品稀釋方法

臨用前小心打開小瓶，將樣品用100mL的無菌生理鹽水（0.9%）溶解，充分震蕩混勻后立即使用。

1.3? ? 檢測方法

按照多管發酵法[6]開展檢測，使用15管發酵方式，即5份10mL、5份1mL和5份0.1mL接種水樣，進行初發酵和復發酵，結果報100mL水樣中的糞大腸菌群數最大可能數。

1.4? ? 檢測結果

8家實驗室的檢測結果及擴展不確定，見表1。

2? ? 結果評價

2.1? ? Grubbs檢驗法

將檢測結果取以10為底的對數值，轉換成近似正態分布，然后Grubbs檢驗法進行異常值檢驗。

2.2? ? 泊松分布置信區間法

單位體積中的分布均勻的細菌數（包括大腸桿菌、糞大腸桿菌等）符合poisson（泊松）分布。該考核樣品標準值為31.1cfu，樣品計數

X≈31，經查poisson（泊松）分布可信區間表[13]，總體均數的置信區間（95%概率）下限值21.0，上限值44.0，用該置信區間進行結果評價。

2.3? ? 改進的En值評價方法

2.3.1? ? En值

式（1）中，x是實驗室的測量結果;Ux是被測物品的參考值;Ux是參加者結果的擴展不確定度（包含因子k=2）;Ux是指定值的擴展不確定度（包含因子k=2）。式（2）是合成不確定度計算公式，可以將Uc認為參考值X的合成不確定度（包含因子k=2），而Ux、Ux為不確定度分量，該公式適用于不確定度對稱分布形式。

2.3.2? ? 評價方法

當，[En]>1結果評價“滿意”;當[En]>1，結果評價“不滿意”。也就是測量結果x落在參考值X的合成不確定度Uc（95%概率）范圍內，則結果評價“滿意”，否則評價“不滿意”。

2.3.3? ? 改進的En值

實質上，公式（2）中，Uc包含2個值Uc（l）和Uc（r），其中，Uc（l）為左側不確定度，即參考值X與下限值之差，它是不確定度分量Ux（l）Ux（l）等合成的;Uc（r）為右側不確定度，即參考值X與上限值之差，它是不確定度分量Ux（r）Ux（r）等合成的。當不確定度對稱分布時，Uc（l）和Uc（r）相等，則Uc=Uc（l）=Uc（r）。當不確定度不對稱分布時，Uc（l）和Uc（r）不相等，則Uc也為不對稱分布，如標準定量菌株不確定度為對稱分布，MPN值的不確定度不對稱分布，則合成不確定度Uc也為不對稱分布。當合成不確定度時，Ux有2個值Ux（l）和Ux（r），其中，Ux（l）為左側不確定度，即MPN值與下限值之差;Ux（r）為右側不確定度，即MPN值與上限值之差。在合成不確定度時，左側和右側可以按照近似正態分布分別合成不確定度，即參考值X的合成不確定度（包含因子k=2）具有左右不對稱性。當x

公式（3）（4）中Ux=Ux（l）=Ux（r），而Ux1=Ux（l）1=Ux（r），因此，分別計算出En（l）和En（r）兩個值，因為類似拖尾峰分布特點，一般En（l）>En（r）。當x

3? ? 結果評價

3.1? ? Grubbs檢驗法評價結論

8家實驗室的結果最大值和最小值的Gn

3.2? ? 泊松分布置信區間法評價結論

如果檢測結果在泊松分布置信區間（95%概率）內，則判定合格，否則判定不合格。評價結論為5家實驗室結果合格，3家實驗室（4、7和8號實驗室）結果不合格，詳見表3。

3.3? ? 改進的En值評價結論

按照改進的En值評價考核結果，6家實驗室結果評價“滿意”，2家實驗室（7、8號實驗室）結果“不滿意”，詳見表4。

4? ? 問題追蹤

針對評價“不合格”或“不滿意”實驗室開展問題追蹤，查閱原始記錄和結果報告單，發現7、8號實驗室初發酵時為陽性的試管，進行復發酵時，有幾支陽性試管變為陰性。這屬于異常情況。因為本次考核用菌株為單一的Escherichia coli NCTC 12241，該菌株在初發酵培養基和復發酵培養基中都能很好的生長，不應該出現陽轉陰的情況。與實驗室操作人員溝通，最終確定為過失誤差，即復發酵接種時，接種環經酒精燈灼燒后，未充分冷卻，導致接菌環上的待接菌燙死，未成活，故復發酵變成陰性。如果排除7、8號實驗室的過失誤差，按照與初發酵相同的陽性試管，得到MPN值為49，該值與泊松分布置信區間評價為“不合格”的4號實驗室相同，對4號實驗室進行問題追蹤，未發現問題。而按照改進的En值評價，這些結果應該判定為“滿意”結果。更關鍵依據是該MPN 值的置信區間17～130，完全覆蓋考核樣品的標準值及其不確定度范圍。問題追蹤結論進一步驗證了改進的En值評價的可行性。

5? ? 結論

（1）結合問題追蹤結果，比較了Grubbs檢驗法、泊松分布置信區間法和改進的En值法的評價結論，不難發現：將微生物偏態分布的結果進行了對數轉換后轉變成近似正態分布，然后采用Grubbs法進行異常值檢驗，判定了8家實驗室均“合格”，顯然評價方法識別精度不夠。泊松分布置信區間法僅僅考慮了微生物檢測結果符合泊松分布的特點，而忽略了標準定量菌株和MPN方法的不確定度。雖然MPN方法的不確定度是基于泊松分布獲得，但不同于泊松分布圖形僅由總體均值u決定，而它還與接種管數量存在反相關，即隨著接種管數量增加，置信區間變窄。例如糞大腸菌群97孔酶底物法較15管多管發酵法的置信區間要窄，97孔酶底物法MPN值33.2時，其95%置信區間為22.4～47.2，該區間是15管多管發酵法的置信區間的一半左右，因此將4號實驗室結果進行了錯誤的判定，顯然該評價方法識別精度過嚴。而改進的En值法不但考慮了標準定量菌株和MPN方法的不確定度，而且還考慮了其分布特點，其評價結論更符合實際情況，更加科學合理。

（2）改進的En值保持了原有En值的優點，通過采用En（l）和En（r）值分別評價，實現對糞大腸菌群（MPN法）的不確定度為不對稱分布的結果評價，評價結論仍為“滿意”和“不滿意”2種情況，當“滿意”時，無需采取進一步措施;當“不滿意”時，產生措施信號。

（3）創新性地將改進的En值評價方法應用于微生物監測領域，尚未見文獻報道。隨著生態環境監測工作的不斷深入，對監測數據質量的要求不斷提高，標準菌株的配備、培養基技術驗收和定量菌株使用等質量控制措施將不斷完善，改進的En值不僅可以評價MPN法的能力驗證/能力考核結果，而且還可以用于日常質控樣品的準確度評價，符合生態環境監測質量管理和質量控制科學化和精細化的要求。

（4）微生物測定結果大多屬于偏態分布，目前常見的處理方式是將測量結果轉換成對數，使其近似正態分布后，再進行精密度或準確度評價。但是，這種處理方式只是近似運算，能否客觀反映原來數據的特性，尚有一定的不確定性。

（5）MPN法的測量結果與化學分析法相比具有較寬的置信區間或不確定度，可以通過增加測定管數[6]（8管或10管）縮小其置信區間或降低其不確定度。

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收稿日期：2020-10-12

作者簡介：王寵（1979-），男，碩士，高級工程師，生態環境監測的質量管理和質量控制。