頂空固相微萃取-氣質分析油茶籽油揮發性成分方法優化

楊剴舟，魏 征，王佳雅，欒 霞，段章群，郭咪咪，楊 茜，薛雅琳

（國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

風味是植物油最具特征的感官屬性，也是評價植物油品質的重要指標[1]。油茶（Camellia Oleifera）作為我國最具特色的木本油料作物，被譽為“東方橄欖油”，主要經過原料精選、炒制、物理壓榨（螺旋壓榨或者液壓榨）以及最后經過濾技術生產而成，因具有濃郁、獨特的風味及豐富的營養價值作用而備受消費者青睞[2]。因此研究和分析油茶籽油的揮發性成分，對進一步提升油茶籽油的風味品質及加工工藝，具有極其重要的意義。

固相微萃取（Solid Phase Micro-Extraction，SPME）是一種新型樣品預處理富集技術，該技術具有無溶劑、靈敏度高、操作簡便和檢測限低（ng/g～pg/g）等優點，并可實現復雜樣品的高通量檢測、自動化分析，與高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）等分析儀器聯用，可實現同一樣品富集、進樣和檢測等過程的統一，顯著提高了分析方法的靈敏度和分析效率[3]。近年來，國內外學者利用固相微萃取（SPME）技術對于油茶籽油風味進行了一系列的研究，包括萃取技術優化[4]、加工工藝[5]對揮發性成分的作用以及不同品種地域風味特性[6]等。Guoyan Liu等[6]、Wenming Cao等[2]和楊春英等[4]分別采用 HSSPME-GC/MS對4種固相微萃取柱吸附效果進行了研究，發現50/30 μm二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）柱子均具有最高的總峰面積、主峰面積和總峰數，但研究都采用水浴手動萃取，對風味物質信號種類和強度存在一定程度的影響；而全自動樣品前處理（加熱、攪拌和萃取）裝置如頂空進樣和CTC樣品自動前處理已逐步開始應用在油脂風味研究中[7]，這對提高風味物質研究的可靠性和準確性提供了可能，但目前缺乏對該技術的優化研究。

因此本文選用壓榨油茶籽油為原料，采用全自動樣品前處理-頂空固相微萃取（HS-SPME）結合 GC/MS技術建立了壓榨油茶籽油揮發性成分的分析方法，并采用該方法對油茶籽油揮發性成分進行了初步鑒定和定量，同時對油茶籽油特征性風味物質進行解析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

壓榨油茶籽油，加工工藝為螺桿壓榨法，毛油經自然沉降制得：北京市建宏中天農林發展有限公司。

1.2 儀器與設備

COMBI-xt PAL氣相色譜多功能自動進樣器暨樣品前處理系統：瑞士CTC公司；Agilent 7890A-5975氣相色譜質譜聯用儀：美國安捷倫科技有限公司；100 μm聚二甲基硅氧烷（PDMS）、75 μm羧基/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）、65 μm 二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）和50/30 μm二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）固相萃取頭：美國Supelco公司；頂空進樣瓶：上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗所需其他試劑均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 風味物質萃取步驟

參考劉曉君等[8]方法。將固相微萃取頭固定后插入GC進樣口進行老化，老化溫度250 ℃，老化時間 30 min，載氣速率 2 mL/min，分流比20∶1。稱取4.00 g樣品置于20 mL頂空瓶中，在CTC進樣系統60 ℃保溫箱中恒溫攪拌20 min，待風味物質飽和后將萃取頭暴露于樣品頂空1.0 cm處解析20 min，最后取出萃取頭在進樣口250 ℃解析，同時啟動儀器采集數據。

1.3.2 固相微萃取條件優化

參考LIU等[6]方法。篩選4種SPME萃取頭100 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB和50/30 μm DVB/CAR/PDMS，分別研究了萃取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、萃取時間（20、30、40、50、60 min）和解析時間（3、4、5、6、7 min）對萃取效果的影響并確定最佳萃取條件。

1.3.3 GC-MS分析

參考LIU等[6]方法。

GC：色譜柱，HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 μm×0.25 μm）；程序升溫：起始溫度 35 ℃，以 4 ℃/min升到 160 ℃，保持 1 min，再以10 ℃/min升到 220 ℃，保持 0.1 min，最后以15 ℃/min升到250 ℃，保持1 min。載氣為高純氦氣，流速0.9 mL/min，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣。

MS條件：離子源，電子轟擊；檢測器電壓70 Ev，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，質量掃描范圍50～500 u。

揮發性組分的定量采用內標法[4]，在樣品中加入20 μL 1.142 mg/mL 1,2,3-三氯甲烷甲醇溶液作為內標，揮發性組分的含量為相當于內標物的相對濃度，計算公式如下：

化合物濃度（mg/Kg油茶籽油）= 化合物峰面積/內標物峰面積×內標物濃度。

1.3.4 相對氣味活度值（ROAV）評價

參考孫寶國[9]方法。采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）對油茶籽油樣品關鍵揮發性組分進行評價，對樣品風味貢獻最大組分的ROAVmax定義為100，其他揮發性組分計算如下：

其中：Ci和Ti分別為揮發性組分的相對百分含量及其對應的嗅覺閾值；Cmax和Tmax為對油茶籽油樣品風味貢獻最大組分的相對百分含量及其對應的嗅覺閾值。

1.4 數據處理

GC-MS分析結果由Mass Hunter軟件檢索計算機譜庫NIST和WILLY定性分析，僅報道匹配度和純度大于 80的鑒定結果（最大值 100），利用面積歸一法計算揮發性成分的相對含量。

2 結果與討論

2.1 萃取條件對萃取效果的影響

2.1.1 萃取頭對萃取效果的影響

采用4種商業化固相微萃取頭PDMS、CAR/PDMS、PDMS/DVB和CAR/PDMS進行篩選，以總峰面積、主峰面積和總峰數來評價萃取頭的萃取效果。其中PDMS用于分析非極性揮發性物質，CAR/PDMS用于分析氣體和小分子量化合物，PDMS/DVB用于揮發性物質、胺類、硝基芳香類化合物等，DVB/CAR/PDMS用于香味物質（揮發性和半揮發性 C3～C20）[10]。具體結果如圖 1所示。

圖1 萃取頭對萃取效果的影響Fig.1 The influence of the extraction head on the extraction effect

從圖 1中可以看出，DVB/CAR/PDMS在總峰面積、主峰面積和總峰數都是最高的，分別為10.07*108、6.94*108和61，總峰面積和主峰面積高于Guoyan Liu等[6]采用TR-5MS柱子對不同固相微萃取柱手動萃取氣質分析得到的結果，DVB/CAR/PDMS分別為8.85*108、6.54*108，其中總峰數低于后者的92個，主要原因是作者采用的茶葉籽油樣品是在炒制溫度 180 ℃和炒制時間20 min下制備的，風味組成更加豐富。吳蘇喜等[7]采用 DVB/CAR/PDMS通過頂空進樣器對不同熱處理壓榨油茶籽油的風味研究時也得到了良好的效果，但是總峰數較少，可能與樣品加工工藝有關。因此選擇DVB/CAR/PDMS固相微萃取柱進行萃取條件優化。

2.1.2 萃取溫度對萃取效果的影響

萃取溫度升高時，待測物揮發成分在頂空的分配提高，縮短萃取平衡時間；但溫度過高會降低待測物在涂層與基質中的分配系數，減少吸附量，影響方法靈敏度，同時溫度過高可能會引起待測樣品在萃取過程中發生如熱降解、氧化反應等一些化學變化，影響檢測結果。具體結果如圖2所示。

圖2 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on the extraction effect

從圖 2中可以看出，隨著溫度的升高，總峰面積和主峰面積逐漸上升，在 70 ℃達到平衡，而總峰數呈現一直上升的趨勢，這與夏欣等[2]、Wenming Cao等[8]和劉曉君等[11]采用手動水浴加熱萃取揮發性物質得出的研究結果不同，后者研究發現總峰面積和主峰面積在萃取溫度高于 60 ℃后均出現了下降。這可能是由于在CTC電加熱固相微萃取體系中，當萃取溫度超過 60 ℃后，油茶籽油中風味物質發生分解以及高溫導致脂肪酸氧化分解，生成的新的風味物質除了彌補風味物質損失，還與風味物質在微萃取柱涂層表面發生競爭性吸附，最終導致總峰數逐漸增加，而總峰面積和主峰面積不增加；同時在水浴加熱體系下，由于加熱方式的不同，造成風味物質的揮發和飽和過程的差異。考慮到高溫下脂肪酸氧化對油脂本體風味物質的干擾以及風味物質的分解，因此選擇60 ℃作為固相微萃取最佳溫度。

2.1.3 萃取時間對萃取效果的影響

萃取時間是萃取過程達到平衡時所需要的時間。萃取過程剛開始時固相微萃取柱的吸附量會出現迅速增加，當達到平衡點后上升趨勢就變得異常緩慢。風味揮發性有機物平衡所需時間較短，一般十分鐘內可達最大吸附量，而復雜基質及半揮發有機物平衡時間一般至少需要30～60 min[8]。

從圖 3中可以看出，隨著萃取時間的增加，總峰數、總峰面積和主峰面積逐漸上升，在50 min時達到平衡，風味物質在固相微萃取柱上的吸附解吸達到平衡。因此選擇萃取時間為50 min進行下一步研究。

圖3 萃取時間對萃取效果的影響Fig.3 The effect of extraction time on the extraction effect

2.1.4 解吸時間對萃取效果的影響

當解吸溫度固定時，解吸時間與風味物質解吸程度緊密相關。時間不足，解析不完全，數據失真，后續樣品受到污染；時間過長，固相微萃取柱涂層在高溫下流失，縮短使用壽命。

從圖 4中可以看出，總峰數、總峰面積和主峰面積受解吸時間影響變化并不顯著，在 5 min時大致達到平衡，考慮到長時間高溫對萃取柱的影響，因此選擇5 min作為較佳的解吸時間。

圖4 解析時間對萃取效果的影響Fig.4 The effect of desorption time on the extraction effect

綜上所述，選擇 DVB/CAR/PDMS固相微萃取柱進行壓榨油茶籽油風味物質萃取實驗，最佳萃取條件為萃取溫度60 ℃，萃取時間50 min，解析時間5 min。

2.2 油茶籽油風味物質氣質分析

采用優化后的HS-SPME/GC-MS技術分離鑒定油茶籽油風味化合物，得到揮發性成分的總離子流圖如圖5所示。經NIST和WILEY數據庫檢索，得到的定性結果和定量結果如表1所示。

圖5 油茶籽油揮發性風味物質總離子流圖Fig.5 Total ion current diagram of volatile flavor compounds in camellia seed oil

表1 油茶籽油揮發性風味物質GC-MS分析結果Table 1 GC-MS analysis results of volatile flavor substances in camellia seed oil

續表1

由表1可知，實驗共鑒定出油茶籽油風味物質共60多種，其中匹配度大于80的約47種，分別為11種醛類、7種醇類、5種呋喃、5種烴類、4種吡嗪、3種酸類、2種吡喃、2種酯類、2種酮類和1種吡咯。

鑒定出的醛類物質含量最高，占油茶籽油揮發性成分的56.28%，濃度為140.29 mg/kg油茶籽油，主要為脂肪族醛，一般被描述為青草味、豆味或酸敗味，如正己醛是亞油酸主要氧化產物之一，反-2-癸烯醛、2-十一碳烯醛和癸醛是油酸的過氧化產物[12]；其次為芳香族醛，苯甲醛和苯乙醛具有與脂肪族醛完全不同的風味特征，分別具有類杏仁味和類蜂蜜味[13]。呋喃類化合物是油茶籽油揮發性成分的第二大化合物，占總含量的16.06%，濃度為 39.99 mg/kg油茶籽油，主要為呋喃醛和呋喃酮類，氣味閾值較低，一般處于mg/kg水平，呋喃類化合物具有焦糖味、甜味、水果味和堅果味等風味特征[13]；醇類化合物是油茶籽油揮發性成分的第三大化合物，占總含量的8.43%，濃度為21.01 mg/kg油茶籽油，一般氣味閾值較高，通常不認為是油脂的風味物質，其中苯乙醇的氣味閾值較低，具有甜玫瑰花味和桃子味[13]。吡嗪類化合物是油茶籽油揮發性成分的第四大化合物，占總含量的 7.58%，濃度為 18.90 mg/kg油茶籽油，一般甲基吡嗪、二甲基吡嗪的氣味閾值相對較高，而甲基或乙基取代吡嗪的閾值相對較低，一般是 μg/kg級別，吡嗪類化合物研究中認為與熱加工中的堅果味、烘烤味、泥土味或土豆味顯著相關[14]；此外鑒定出一種酮類化合物2-壬酮，通常被描述為玫瑰花味和茶葉味；一般酯類和烴類物質氣味閾值相對較高，一般不認為是油脂的風味物質。

羅凡等[15]采用 HS-GC研究不同炒制條件下壓榨油茶籽油的揮發性成分組成時發現約 18種主要揮發性成分，在炒制溫度140 ℃時，醛類物質約為 46.84%，呋喃類約 11.91%，醇類約為10.92%等，相對含量與我們的差別較大，可能與采用的萃取技術有關。況小玲等[16]采用 GC-MS對螺旋壓榨法制備的油茶籽油風味組分分析發現，得到的風味物質為 57種，其中醛類物質59.23%，酸類物質16.89%，醇類物質9.16%，烴類物質 5.62%，雜環類 0.48%，除了酸類和雜環類，其他與我們的結果基本一致。

2.3 油茶籽油風味物質ROAV分析

風味物質對于油脂整體風味的貢獻除了與含量有關以外，還與風味物質的閾值緊密相關。因此通過比較風味物質的相對氣味活度值可以近似判定整體風味貢獻度。一般認為 ROAV≥1的物質為樣品中的關鍵性揮發組分，而0.1≤ROAV<1的物質為樣品中重要的修飾組分[9]。結合油茶籽油揮發性組分的相對百分含量（4.40%）和嗅覺閾值（0.7 μg/kg），確定辛醛的相對氣味活度值ROAVmax=100。油茶籽油揮發性風味物質相對氣味活度值如表2所示。

從表2中可以看出，ROAV>100的風味物質為2-氫-3-羥基-4,4-二甲基-2（3H）呋喃酮和二羥基-2（3H）呋喃酮，該類化合物主要在炒籽后期產生，一般具有甜焦糖味；其次為ROAV=100的辛醛，一般具有脂肪味、柑橘味和蜂蜜味；再次為0.1≤ROAV<1，2-甲基丙醛、苯乙醛、壬醛、正己醛、反-2-壬烯醛、癸醛、1-庚醇、3-乙基-3,5-二甲基-吡嗪，主要為醛類物質，一般為脂肪味、青草味和香橙味等，輔以吡嗪的堅果味和燒烤味；最后是ROAV≈0.1的1-辛烯-3-醇和2-戊基呋喃，一般為香草味、薰衣草味、玫瑰香味和水果香味等。上述14種風味物質各具特點，通過相互之間的協同作用，共同構成了油茶籽油特征風味物質。李梓銘等[17]通過HS-SPME-GC-MS對物理壓榨油茶籽油揮發性物質進行分析并結合相對氣味活度值發現，壓榨油茶籽油中特征風味物質（17種）主要由醛類物質（10種）組成，和我們的研究結論相對一致，但我們研究中關鍵性風味物質為呋喃酮類物質，醛類等為風味修飾成分，而后者醛類作為關鍵性風味成分，分別為辛醛、壬醛、反-2-癸烯醛、2-庚烯醛、甲酸辛酯、己醛、庚醛、庚醇和2-戊基呋喃。

表2 油茶籽油揮發性風味物質相對氣味活度值Table 2 Relative odor activity value of volatile flavor substances in camellia seed oil

3 結論

本文采用全自動樣品前處理-頂空固相微萃取（HS-SPME）結合氣相色譜-質譜聯用（GC/MS）技術建立了壓榨油茶籽油揮發性成分的分析方法，最佳的萃取條件為：DVB/CAR/PDMS固相微萃取柱，萃取溫度60 ℃，萃取時間50 min，解析時間5 min，相比較傳統手動水浴萃取法具有更高的總峰面積和主峰面積；采用該技術共鑒定和定量出壓榨油茶籽油揮發性成分47種，其中醛類化合物是油茶籽油中主要的揮發性成分；通過ROAV分析得到壓榨油茶籽油的特征風味物質為2-氫-3-羥基-4,4-二甲基-2（3H）呋喃酮、二羥基-2（3H）呋喃酮、2-甲基丙醛、苯乙醛、壬醛、正己醛、反-2-壬烯醛、癸醛、1-庚醇、3-乙基-3,5-二甲基-吡嗪。