基于網絡藥理學和分子對接分析芪參益氣滴丸治療急性冠脈綜合征的作用機制*

王朔 ，杜雪晨 ，趙佳 ，周伽 ，李春潔

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天津市胸科醫院，天津 300222）

《中國心血管健康與疾病報告2019》指出，中國心血管患病率仍呈持續上升態勢，推算冠心病患者約占心血管患病總數的3.33%，且心血管病死率仍占首位，而急性冠脈綜合征（ACS）是導致心血管病死率居高不下的重要原因[1]。ACS是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂、侵襲，繼發完全或不完全閉塞性血栓形成為病例基礎的一組臨床征象，主要包括急性ST段抬高性心肌梗死（AMI），急性非ST段抬高性心肌梗死以及不穩定型心絞痛（UA）[2]。

對于ACS的治療以經皮冠狀動脈介入治療（PCI）為常見方案，但PCI術后易造成血管機械性損傷及再狹窄等事件，導致繼發性心絞痛[3]。目前，臨床對于PCI術后藥物治療以抗血小板聚集、降脂類藥物為主，但治療效果相對有限。

中醫學將ACS歸屬于胸痹、心痛范疇。《醫林改錯》有云“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”，認為其病位在于心，基本病機為瘀血內停、日久氣虛，病性總屬本虛標實，以氣虛為本，血瘀為標，治當扶正祛邪，益氣活血[4]。芪參益氣滴丸（QSYQ）是中醫臨床上常見的治療氣虛血瘀型胸痹的推薦中成藥，具有益氣通脈，活血止痛的功效。臨床研究表明，QSYQ可有效改善AMI患者PCI術后血清炎癥水平，減輕心梗面積，改善心功能及內皮功能[5-6]。此外，QSYQ聯合西藥可有效緩解UA患者的癥狀，降低心絞痛發作頻率，減少主要心血管不良事件發生率[7-8]。

然而，中藥復方具有化學成分復雜、作用機制多樣的特點，QSYQ治療ACS的物質基礎及作用機制尚不明確。因此，利用網絡藥理學和分子對接的方法對QSYQ治療ACS的活性成分和作用靶點進行分析，對于解釋其治療ACS的作用機制并拓寬臨床思路有重要意義。

1 材料與方法

1.1 QSYQ有效成分及核心作用靶點篩選的方法分別以QSYQ的藥物組成黃芪、丹參、三七、降香為關鍵詞，按照口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選標準，在 TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及 Batman（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）平臺分別檢索有效成分，并提取對應作用靶點。

1.2 AMI和UA靶點的收集的方法 通過Gene Cards （https：//www.genecards.org/），OMIM（https：//omim.org/），drugbank（https：//go.drugbank.com/），pharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/），TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/），CTD（http：//ctdbase.org/）平臺，分別以“Acute myocardial infarction”、“Unstable angina pectoris”為關鍵詞進行檢索，明確疾病相關靶點。

1.3 QSYQ治療AMI和UA的潛在作用靶點確定的方法 將QSYQ與AMI和UA疾病靶點取交集，得到二者的交集靶點，即QSYQ治療AMI和UA的潛在作用靶點。

1.4 “藥物-有效成分-作用靶點-疾病”網絡構建的方法 將藥物、有效成分、作用靶點、疾病的相關數據信息導入Cytoscape3.7.2軟件并建立網絡圖。

1.5 PPI網絡的構建及分析的方法 將作用靶點上傳至STRING數據庫，導入Cytoscape3.7.2軟件，繪制PPI網絡圖，以≥2倍DC中位數21，再取≥2倍BC中位21.3數作為篩選標準，得到關鍵靶點。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的方法 將作用靶點上傳至DAVID平臺，對潛在有效靶點進行GO和KEGG注釋分析。

1.7 關鍵活性成分-關鍵靶點分子對接的方法 下載小分子配體文件2D結構，下載核心靶點蛋白質結構，除去水分子，分離原配體，加氫、格式化后保存大分子受體，利用Autodock Tools 1.5.6確定受體和配體結合的可能區域。進行分子對接，以結合能≤-5.0 kJ/mol作為篩選標準，建立對接相互作用模式圖。

2 結果

2.1 QSYQ有效成分及核心作用靶點篩選 利用TCMSP及Batman平臺，分別以黃芪、丹參、三七、降香為關鍵詞，檢索有效成分，共得到有效成分130個，其中黃芪20個、丹參65個、三七8個、降香37個。利用TCMSP平臺檢索有效成分對應靶點，其中黃芪943個、丹參2 652個、三七709個、降香965個，經去重后得到作用靶點2 022個，以OB值大小排序，列出前10位有效化學成分，見表1。

表1 QSYQ有效成分信息表Tab.1 Active ingredient information of QSYQ

2.2 AMI和UA的相關靶點 分別以“Acute myocardial infarction”“Unstable angina pectoris”為關鍵詞檢索，分別得到相關靶點747個、155個。

2.3 QSYQ治療AMI和UA的潛在作用靶點 將QSYQ作用靶點分別與AMI和UA相關靶點進行交集，得到共同作用靶點36個，見圖1。

圖1 “藥物-有效成分-作用靶點-疾病”互作網絡圖Fig.1 Interaction network diagram of“drug-active ingredient-target-disease”

2.4 PPI網絡圖構建及分析 將共同作用靶點導入STRING平臺，得到蛋白互作信息，見圖2。建立PPI網絡圖，見圖3。篩選出關鍵靶點7個：IL-6、SERPINE1、IL-1B、TP53、NOS3、FOS、F3。

圖2 蛋白質相互作用圖Fig.2 Protein interaction diagram

圖3 PPI網絡圖Fig.3 PPI network diagram

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析GO功能富集分析經篩選共得到217條，其中生物過程180條，分子功能18條，細胞組分19條，見圖4。KEGG通路富集分析經篩選共得到69條，見圖5。

圖4 GO功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 關鍵活性成分-關鍵靶點分子對接 以PPI蛋白互作網絡選取7個關鍵靶點與相應關鍵活性成分進行分子對接，見表2。建立分子對接互作模式圖，結果顯示所有關鍵靶點與關鍵活性成分均可自發結合，形成較為穩定的構象，說明QSYQ關鍵活性成分與治療AMI、UA的關鍵作用靶點具有較好的結合活性，見圖6。

圖6 QSYQ關鍵活性成分與關鍵靶點分子對接互作模式圖Fig.6 Interaction diagram of QSYQ key active ingredients and key target molecules

表2 QSYQ關鍵活性成分與關鍵靶點結合能Tab.2 Binding energy of QSYQ key active ingredients and key target

3 討論

本研究通過網絡藥理學篩選得到QSYQ的成分主要有槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、芒柄花素、丹參酮ⅡA、人參皂苷rh2等。研究顯示，槲皮素可通過上調SIRT1降低心肌梗死的微血管通透性[9]。木犀草素發揮抗心肌損傷的作用可能與NF-κB通路相關[10]。β-谷甾醇通過ERKI/2信號通路發揮抗心肌氧化應激和炎癥損傷，減輕心肌細胞凋亡[11]。芒柄花素可調節TNF-α、IL-1β水平，發揮抗心肌缺血的作用[12]。丹參酮ⅡA通過調節AngⅡ-（AT-1R）-Cx43信號通路，發揮抗冠心病血瘀證再灌注損傷的作用[13]。人參皂苷rh2可明顯改善氧化應激及炎癥水平，增加心肌缺血再灌注后血EPCs[14]。

通過“藥物-有效成分-作用靶點-疾病”的網絡，發現 PTGS2、NOS2、CASP3、TNF、CCND1、ICAM1、IFNG、MMP9、TP53、CD40LG 等核心靶點而達到治療ACS的作用。PTGS2（COX2）是NF-κB的下游因子，NF-κB活化后，啟動COX2的轉錄，上調TNF-α，IL-1β，IL-6，ICAM1 的表達，在機體免疫、炎癥中發揮作用，并且可升高Caspase3水平，誘導心肌細胞凋亡[15]。CD40L是活化的CD40細胞，在心臟功能異常情況下大量分泌，與炎細胞水平呈正相關[16]。NOS2通過cGMP途徑對下游靶蛋白進行磷酸化等多種翻譯及修飾，引起心肌損傷[17]。TP53INP1介導p53的抗氧化活性，表達升高易導致心肌細胞自噬小體的破裂，加重心肌損傷[18]。

GO富集分析發現，QSYQ治療ACS的生物學功能主要體現在一氧化氮生物合成過程的正調控、對缺氧的反應、細胞對脂多糖的反應、細胞外間隙等方面。KEGG通路顯示，QSYQ各關鍵靶點主要涉及TNF信號通路、NF-κB信號通路、NOD樣受體信號通路、HIF-1信號通路等。缺血時HIF-1α的表達是內源性保護機制的始動因子和共同途徑，此時HIF-1α表達降低，加重心肌損傷程度，降低心功能[19]。NOD樣受體蛋白3調節心肌細胞焦亡，而由其介導的心肌損傷可能與調控NLRP3相關，同時研究表明改善NF-κB信號通路、TNF信號通路相關的IL-6，IL-1β，Caspase1等炎癥因子水平，有利于減輕心肌細胞損傷[20]。

綜上，本研究通過網絡藥理學聯合分子對接的方法，發現槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、芒柄花素、丹參酮ⅡA、人參皂苷rh2等為QSYQ的主要活性成分，PTGS2、NOS2、CASP3、TNF、CCND1、ICAM1、IFNG、MMP9、TP53、CD40LG為主要作用靶標，主要與TNF信號通路、NF-κB信號通路、NOD樣受體信號通路、HIF-1信號通路等通路相關，分子對接驗證了木犀草素、槲皮素、人參皂苷rh2、丹參酮ⅡA的化合物與 IL-6、SERPINE1、IL-1B、TP53、NOS3、FOS、F3 的核心靶點。鑒于網絡藥理學和分子對接的局限性，后期需對本研究結果進行，為QSYQ治療ACS提供實驗和臨床依據。