巖藻多糖對Aβ25-35 誘導神經元凋亡和突起萎縮的抑制作用

楊志友，馬智慧，張永平，宋 采，胡雪瓊

（1.廣東海洋大學食品科技學院//廣東省水產品加工與安全重點實驗室//廣東省海洋生物制品工程實驗室//廣東省海洋食品工程技術研究中心//水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江，524088；2.大連工業大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連，116034）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種長期進行性的神經退行性疾病。目前我國約有1 000 萬阿爾茨海默病患者，居世界首位，同時我國也是全球新發病例增速最快的國家之一。現在臨床上用于治療阿爾茨海默病的藥物如膽堿酯酶抑制劑rivastigmine 和NMDA 受體抑制劑memantine屬于對癥療法，并不足以改善患者的記憶功能，且伴隨著嚴重的副作用[1-2]。Aβ 老人斑和神經原纖維纏結是阿爾茨海默病的兩大病理學特征[3]，Aβ 級聯假說認為神經突起萎縮和突觸丟失處于神經細胞死亡的上游并構成了AD 的病理學基礎[4]。以Aβ和Tau 蛋白為作用靶點設計的藥物Solanezumab[5]和TauRx0237[6]均在三期臨床中以失敗告終，這說明疾病的發生機制與藥物的治療作用機制可能是以不同的信號通路實現的。有研究表明，Aβ 會誘導突觸丟失和軸突萎縮[7]，而軸突萎縮在阿爾茨海默病中啟動并加速腦神經元細胞死亡，最終導致神經元網絡的破壞和記憶丟失[8]。因此，促進突起再生和保護神經元進而重建受損的神經網絡可能是AD 記憶修復的關鍵。

藻類是海洋生物活性物質的重要來源，目前已發現的海洋生物活性物質中約40%來自藻類[9]。海帶（Laminaria japonica）是一種常用的藥食同源藻類，其主要活性成分是海帶巖藻多糖（Fucoidan）。海帶巖藻多糖是一種富含巖藻糖的硫酸鹽聚合物，具有廣泛的藥理學作用，如抗衰老[9]、抗炎癥性腸病[10]、抗腫瘤[11]、提高免疫[12]、抗病毒[13]、改善Aβ1-40 誘導的記憶損傷[14]等，然而，是否具有改善Aβ 誘導的神經細胞損傷和神經突起再生的作用尚未見報道。因此，本研究從巖藻多糖抗神經損傷的角度出發，探討其對Aβ 誘導的神經元凋亡的保護和突起再生的作用，以期為其對AD 的治療提供理論和實驗依據，也可為海藻來源多糖的藥物研發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗試劑與細胞株 巖藻多糖（Fucoidan）購自上海源葉生物科技有限公司（S11142），SH-SY5Y 細胞購于中國科學院上海分院細胞庫，胎牛血清 FBS（10270-106 ）、MEM 培養基（C11095500BT）、F12 培養基（C11765500BT）、DNase I/Trypsine抑制劑（18047-019 和17075-011）、0.05% 和 0.25% Trypsin-EDTA（25300-054 和25200-072）、馬血清（26050-088）購于美國Gibco公司。一次抗體β3-tubulin（sc-80005）購于SantaCruz公司，一次抗體MAP2 和熒光488/594 nm 標記的山羊抗兔/鼠二次抗體購于Abcam 公司。

1.1.2儀器和設備 酶標儀、自動細胞計數儀，Bioteck 儀器公司；倒置熒光顯微鏡，OLYMPUS IX73；二氧化碳恒溫培養箱，美國Crystal 公司。

1.2 方法

1.2.1SH-SY5Y 細胞培養 SH-SY5Y 細胞培養采用MEM/F12 培養基（含體積分數15% FBS，100 U/L青霉素和100 μg/L 鏈霉素），于37 ℃、體積分數5% CO2的飽和濕度培養箱中生長，取對數生長期的細胞接種于培養板進行實驗。

1.2.2小鼠大腦皮層原代神經元培養 胎鼠大腦皮層中神經元的分離方法參照前期研究[15]。簡述如下，取懷孕14 d 的ICR 胎鼠大腦皮層，去掉硬腦膜，剪碎，加入質量分數0.05%的Trypsin-EDTA 于37 ℃消化15 min，用含質量分數0.6%葡萄糖、體積分數12%馬血清和2 mmol/L L-谷氨酰胺的Neurobasal 培養基（HS 培養基）終止消化，然后加入600 U/mL DNase I 和0.3 mg/mL 的Trypsine 抑制劑，37 ℃孵育15 min，加入HS 培養基后，離心（90 g，3 min）去上清，用CMF-HBSS 緩沖液重懸、離心兩次，將細胞重懸于HS 培養基中，過孔徑0.45 μm 濾膜，將細胞接種于8 孔板中。

1.2.3巖藻多糖對SH-SY5Y 細胞毒性作用檢測實驗分為對照組（Cont）和巖藻多糖組（0.1、1.0、10.0、100.0 μg/mL 和1、5、10、20、30 mg/mL）。將SH-SY5Y 細胞接種于96 孔板中（5 × 104mL-1，100 μL），每組6 個復孔，培養24 h，用全反式維甲酸（RA）誘導神經分化6 d 后，加入0.1～ 30 000 μg/mL 的巖藻多糖，繼續培養24 h。每孔加入CCK8（APExBIO，K1018）試劑10 μL，繼續培養2 h，用酶標儀于450 nm 處測定光密度值。

1.2.4巖藻多糖對Aβ25-35 致SH-SY5Y 細胞損傷的作用 實驗分為對照組（Cont）、模型組（Aβ25-35 20 μmol/L）和巖藻多糖組（0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 μg/mL）。將SH-SY5Y 細胞接種于96 孔板中（5 × 104mL-1，100 μL），每組6 個復孔，培養24 h，用全反式維甲酸（RA）誘導神經分化6 d 后，加入0.1～ 1 000 μg/mL 的巖藻多糖，1 h 后，每孔加入2 μL Aβ25-35（1 mmol/L）至終濃度為 20 μmol/L，37 ℃培養24 h 后，CCK8 法測定450 nm處光密度值。

1.2.5巖藻多糖對Aβ25-35 致原代小鼠大腦皮層神經細胞損傷的作用 實驗分對照組（Cont）、模型組（Aβ25-35 10 μmol/L）和巖藻多糖組（0.01、0.10、0.50、1.00 mg/mL）。將原代皮層神經細胞接種于96 孔板（2 × 105mL-1，100 μL）中，每組5 個復孔，培養3 d 后，加入0.01～ 1.00 mg/mL 的巖藻多糖，1 h 后，加入Aβ25-35（10 μmol/L）處理24 h 后，用CCK8 法測定細胞存活率。

1.2.6巖藻多糖對Aβ25-35 致皮層神經突起萎縮的作用 原代皮層神經細胞接種于8 孔板（5 × 104mL-1，400 μL）中，培養3 d 后，加入不同質量濃度的巖藻多糖（0.1 和1.0 mg/mL），1 h 后，加入Aβ25-35（10 μmol/L），共培養3 d 后，棄去上清，質量分數4% 多聚甲醛（PFA）固定1 h，加入一次抗體β3-tubulin（突起染色）和MAP2（神經元胞體和樹突染色）于4 ℃孵育12 h，然后加入激發波長594/488 nm 熒光探針標記的山羊抗鼠/兔二次抗體，DAPI 用于細胞核的染色。使用倒置熒光顯微鏡拍攝照片，每組拍攝10 張，用ImageJ（NIH）軟件分析β3-tubulin 和MAP2 染色陽性的神經突起密度。

1.2.7巖藻多糖對正常皮層神經突起再生的作用 原代皮層神經細胞接種于8 孔板（4 × 104mL-1，400 μL）中，培養2 d 后，加入不同質量濃度的巖藻多糖（0.1和1.0 mg/mL），繼續培養4 d，棄上清，分別用β3-tubulin 和MAP2 對細胞進行染色，DAPI 用于細胞核染色。用ImageJ 軟件統計分析神經突起密度。

1.3 統計學分析

實驗重復3 次，結果以平均值±SEM 表示。用ImageJ、GraphPad Prism 5.0 對數據進行統計學分析并制圖。對于不符合正態分布的細胞存活率結果（圖1-3），進行平方根反正弦轉換后[16]，用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Dunnett 檢驗進行組間比較，P <0.05 被認為有顯著的統計學差異。

2 結果與分析

2.1 巖藻多糖對SH-SY5Y 細胞毒性作用

圖1 中，與對照組（Cont）相比，加入0.1～ 1 000 μg/mL 巖藻多糖組SH-SY5Y 細胞存活率無明顯變化（P >0.05），隨著巖藻多糖濃度的升高，5～30 mg/mL 巖藻多糖組顯著降低SH-SY5Y 細胞存活率（P <0.05），說明高濃度巖藻多糖對細胞有一定毒性，因此選擇0.1～ 1000.0 μg/mL 巖藻多糖進行后續實驗。

圖1 巖藻多糖對SH-SY5Y 細胞存活率的作用Fig.1 The effect of Fucoidan on SH-SY5Y cell survival rate

2.2 巖藻多糖對Aβ25-35 致SH-SY5Y 細胞損傷的保護作用

前期研究發現，20 μmol/L 的Aβ25-35 作用24 h可顯著降低 SH-SY5Y 細胞存活率[17]，因此，SH-SY5Y 細胞系AD 模型用20 μmol/L Aβ25-35。0.1～1 000.0 μg/mL 巖藻多糖作用于細胞1 h 后，加入Aβ25-35 處理24 h。與對照組（Cont）相比，模型組（Veh）細胞存活率顯著降低（P <0.001），而與模型組相比，巖藻多糖10～ 1 000 μg/mL 組細胞存活率顯著升高（P <0.05），且有濃度依賴性。表明巖藻多糖可抑制Aβ25-35 誘導的SH-SY5Y 細胞損傷（圖2）。

圖2 巖藻多糖抑制Aβ25-35 誘導的SH-SY5Y 細胞凋亡Fig.2 Fucoidan inhibits Aβ25-35 induced SH-SY5Y cell apoptosis

2.3 巖藻多糖對Aβ25-35 致小鼠原代皮層神經元損傷的保護作用

本課題組前期研究發現[15]，10 μmol/L 的Aβ25-35 作用于神經元3 d 后，細胞存活率顯著降低，與對照組相比差異顯著（P <0.05）。巖藻多糖預處理1 h 后與Aβ25-35 共培養3 d，結果發現，0.1、0.5 和1.0 mg/mL 的巖藻多糖組細胞存活率明顯升高（P <0.01），表明巖藻多糖能夠抑制Aβ25-35 誘導的原代神經元損傷（圖3）。

2.4 巖藻多糖對Aβ25-35 致小鼠原代皮層神經元突起萎縮的抑制作用

通過構建Aβ25-35 誘導的神經元突起萎縮模型，探討巖藻多糖對神經突起萎縮的抑制作用，結果見圖4。結果顯示，與對照組（Cont）相比，10 μmol/L 的 Aβ25-35 顯著降低 β3-微管蛋白（β3-tubulin）陽性的突起密度（P <0.001）。與模型組（Veh）相比，0.1 和1 mg/mL 的巖藻多糖組均能顯著增加突起密度（P <0.001），表明巖藻多糖可以抑制Aβ25-35 誘導的原代神經元突起萎縮。

圖4 巖藻多糖改善Aβ25-35 誘導的原代皮層神經元突起萎縮Fig.4 Fucoidan ameliorates Aβ25-35 induced primary cortical neurites atrophy

續圖4（Continued）

2.5 巖藻多糖對正常原代皮層神經元突起再生的作用

為探討巖藻多糖改善Aβ25-35 誘導的原代皮層神經元突起萎縮的作用是源于對Aβ 的抑制作用還是對神經元突起的再生作用，測定巖藻多糖對正常培養的神經元突起再生的作用（圖5）。免疫熒光染色結果表明，與對照組相比，巖藻多糖0.1 和1.0 mg/mL 組能顯著增加β3-tubulin 陽性染色的突起密度（P <0.01）。結果說明巖藻多糖具有促進神經元突起再生的作用。

圖5 巖藻多糖對正常培養的原代皮層神經元突起的再生作用Fig.5 Effect of Fucoidan on normal cultured primary cortical neurites regrowth

3 討論

Aβ 老人斑和神經元纖維纏結是AD 的兩大病理性特征。有研究表明，Aβ 寡聚體能夠加速Tau蛋白的磷酸化，促進神經突起解聚和萎縮，增大鈣離子內流，最終促進神經元的死亡[7]。神經元的大量死亡造成神經元之間的網絡聯結破壞，信息在神經元間的傳遞終止，造成大腦對信息存儲、保持和再現功能破壞，從而導致記憶損傷[8]。因此，通過促進萎縮的神經元突起再生，進一步整合到已有的神經元網絡可能是改善記憶的關鍵。本課題組前期研究結果也表明，一些促進軸突或樹突再生的化合物能夠明顯增強正常小鼠的認知和空間記憶能力[15]。本研究發現，巖藻多糖能夠顯著抑制Aβ 誘導的神經細胞凋亡，表明其具有很好的神經保護作用。同時，巖藻多糖能夠促進正常神經元突起的再生，提示其改善記憶的作用也可能是通過重新構建破環的神經元局部回路與神經網絡實現的。

海帶中巖藻多糖一般為硫酸酯化多糖，分子質量和極性都相對較大，血腦屏障的透過性是保證其直接作用于大腦神經元的關鍵。有研究表明[18]，利用平行人工膜滲透試驗（PAMPA）發現巖藻多糖的分子透過率值為10.4 × 10-6cm?s-1，推測其具有優良的血腦屏障穿透性。Xu 等[19]利用Caco-2 細胞模型，將FITC 熒光標記物嵌合到巖藻多糖分子中，發現巖藻多糖膜透過性良好，其在細胞膜上的轉運作用是通過網格蛋白介導的內吞作用實現的，提示其可能具有透過血腦屏障的能力，但進一步研究發現巖藻多糖吸收后快速在腎臟和肝臟中富集，在腦和心臟中未檢測到巖藻多糖存在。甘露寡糖二酸（GV-971）是從海藻中提取的海洋寡糖類分子，在2019 年被國家藥品監督管理局批準有條件上市，用于治療輕至中度阿爾茨海默病。研究表明，GV971能在葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）的作用下透過血腦屏障，解聚Aβ 聚合體并抑制Aβ 寡聚體形成，同時還通過調節腸道菌群失衡、重塑機體免疫穩態，進而降低腦內神經炎癥，多靶點阻止AD 病程進展[20]。黃娟等[21]發現高分子質量的巖藻多糖可以調控小鼠腸道菌群并修復環磷酰胺誘導的小鼠免疫功能。因此，巖藻多糖是否也是通過GLUT1 透過血腦屏障直接作用于神經元并通過調控腸道菌群等多靶點改善記憶尚需進一步驗證。

本研究通過建立AD 體外細胞損傷模型，首次發現巖藻多糖對Aβ25-35 誘導的原代皮層神經元的損傷具有保護作用，且對其誘導的神經突起萎縮具有再生作用。而巖藻多糖促進神經再生和神經元保護的作用靶點和作用機制有待進一步的研究。研究發現，巖藻多糖可以減少轉基因AD 秀麗線蟲中Aβ的積聚和 ROS 的產生，從而改善線蟲（Caenorhabditis elegans）的運動行為[22]。Zhang等[23]發現巖藻多糖可以通過抑制溶酶體組織蛋白D 的活性而抑制H2O2誘導的PC12 細胞凋亡，Wei等[24]發現巖藻多糖可以抑制PC12 細胞凋亡并改善AD 小鼠的記憶障礙，其作用機制可能與膽堿能系統調節、減少氧化應激和抑制Caspase 凋亡通路有關。巖藻多糖的分子結構較為復雜，硫酸基取代和巖藻糖支鏈連接方式多樣，給揭示其抗AD 和神經元保護的作用機制帶來困難，因此，在后續研究中通過對巖藻多糖進行純化和結構鑒定，得到結構和分子量均一的巖藻多糖，將有助于闡明其對神經元突起再生和AD 記憶改善的作用機制。

4 結論

巖藻多糖可有效抑制Aβ誘導的SH-SY5Y細胞和原代皮層神經元凋亡，抑制Aβ 誘導的突起萎縮并促進神經突起再生。