百合資源抗棉蚜性鑒定及遺傳多樣性分析

周俐宏，石 慧，楊迎東，崔玥晗，楊盼盼，徐雷鋒，明 軍*

（1.遼寧省農業(yè)科學院花卉研究所，沈陽 110161；2.中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3.沈陽農業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866）

百合（Liliumspp.）是世界上重要觀賞花卉之一，在世界切花市場上占有重要地位。棉蚜（Aphis gossypiiGlover）是危害百合害蟲之一，危害百合植株健康和觀賞性，作為傳播媒介更是百合病毒病主要誘因。目前，防治蚜蟲多采用化學防治，但長期采用化學藥劑，致使蚜蟲逐漸產生群體抗藥性，防治效果降低，迫使加大用藥量和噴灑頻率，增加生態(tài)環(huán)境風險[1]。培育抗蚜蟲品種是有效解決蚜蟲脅迫重要途徑之一，獲得抗蚜種質是實現(xiàn)抗蟲育種目標前提和基礎。因此，對百合種質資源開展抗蚜性評價，分析其遺傳關系，可更有針對性選育抗蚜新品種，為抗蟲材料綜合應用和抗蟲遺傳研究提供參考。

目前植物抗蚜性鑒定已在馬鈴薯[2]、苜蓿[3]、蕓薹屬[4]、小麥[5]、菊屬[6]、西瓜[7]、黃瓜[8]等作物上廣泛應用。百合抗蚜研究比較薄弱[9]，亟待開展。SSR標記具有共顯性、高度多態(tài)性、全基因組覆蓋、重復性好等優(yōu)點而被廣泛應用。近年，隨著百合轉錄組數(shù)據的獲得，百合中SSR標記開發(fā)迅速發(fā)展[10]，500余條百合SSR引物已得到驗證，在百合中表現(xiàn)高度多態(tài)性[11-12]。國內外學者已應用分子標記技術尤其是SSR標記技術對百合種間和種內遺傳多樣性以及依據遺傳關系推測選擇親本開展相關研究[13-14]。但對不同抗蚜能力類群百合種質資源間遺傳關系研究未見報道。

根據原產地和親本來源不同，國際百合協(xié)會將百合分為9個種系[15]，本研究選用60份百合資源涵蓋其中5個種系，對其開展抗蚜蟲評價，選用嚴格篩選后的6對SSR引物作熒光標記，利用全自動基因分析儀檢測多態(tài)性位點，分析不同抗蚜級別百合資源遺傳多樣性，以期為百合抗蚜育種親本選擇提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

抗蚜性鑒定從2017～2019年執(zhí)行3個年度重復測試。每年5月初將60份百合資源，包括11份野生種、49份栽培品種定植于冷棚中，每年7月初鑒定抗蚜性。試驗材料定植于遼寧省農業(yè)科學院花卉研究所西地試驗地。

1.2 方法

1.2.1 百合資源抗棉蚜性鑒定

1.2.1.1 人工蚜蟲接種

上午10點左右，用毛筆小心將棉蚜2齡若蟲接種到蕾期植株頂部嫩葉上，每株接種5頭，3次重復。接種10 d（蚜蟲繁殖2代）時，調查供試植株上蚜蟲數(shù)量。蚜蟲接種和數(shù)量統(tǒng)計參照Deng等方法[16]。

1.2.1.2 抗蚜蟲性評價

抗性評價采用蚜量比值法，蚜量比值=某材料蚜量/全部觀察材料平均蚜量。根據百合蚜量比值不同，可將抗蚜性分為5級：高抗：0～0.25；抗蟲：0.26～0.50；中抗：0.51～0.75；感蟲：0.76～1.25；高感：1.25以上[16]。

1.2.2 抗感棉蚜資源遺傳多樣性分析

1.2.2.1 DNA提取與檢測

每份材料選取幼嫩葉片1 g，MP Fastprep-24設備研磨，植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.2.2.2 PCR擴增與標記檢測

根據Du等發(fā)表引物信息[12]，共選取50對SSR引物合成。對篩選出6對SSR標記（見表1）正向引物5'末端用FAM、HEX、TAMRA 3種熒光染料中一種作標記。引物合成和標記由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

PCR擴增體系包含20μL反應體積，其中Taq聚合酶0.4μL、10×PCR buffer 2μL、正向引物和反向引物各0.5μL、dNTPs 1μL、基因組DNA 2μL和ddH2O 13.6μL。PCR反應程序為94℃5 min；94℃30 s，58℃45 s，72℃45 s，35個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。PCR產物經3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將電泳條帶顯示清晰PCR產物送上海生工生物工程股份有限公司作毛細管電泳熒光檢測。

1.2.2.3 數(shù)據統(tǒng)計與分析

GenAIEx 6.51b2計算每對引物等位基因數(shù)（Allele number）、有效等位基因數(shù)（Effective allele number）、基因多樣性指數(shù)（Gene diversity index，H）；Popgen32計算SSR引物主要等位基因頻率（Major allele frequency）、Shannon信息指數(shù)（Shannon's Information index，I）；PIC_CALC計算多態(tài)性信息含量指數(shù)（Polymorphism information content，PIC）。在MEGA 6.06中構建遺傳聚類圖。

2 結果與分析

2.1 百合資源抗蚜性等級鑒定

2017～2019年利用人工蚜蟲接種和蚜量比值法共鑒定72份百合資源，其中，60份資源抗蚜性能力表現(xiàn)穩(wěn)定。根據蚜量比值法可分為5級（見圖1、表2），31份資源為高抗材料，7份資源為抗蟲材料，4份資源為中抗材料，6份資源為感蟲材料，12份資源為高感材料。在31份高抗資源中，亞洲百合和麝香百合×亞洲百合雜交種占54.84%（見圖2a），而這兩個雜種系主要親本是抗蚜野生種細葉百合、有斑百合、朝鮮百合、大花卷丹等[17]，說明亞洲百合雜種系和麝香百合雜種系是百合抗蚜育種重點資源。在12份高感百合資源中，東方百合和東方百合×喇叭百合雜交種占50%，野生種資源占41.67%（見圖2b），東方百合和喇叭百合雜種系主要親本為湖北百合、毛百合[17]，鑒定結果表明為感蚜種，說明東方百合雜種系是相對易感蚜蟲百合資源。

圖2 高抗蚜（a）和高感蚜（b）等級中不同類型百合資源Fig.2 Different types of lily resources in high resistance(a)and high susceptible(b)groups

表2 60份百合資源抗蚜性等級鑒定結果Table 2 Grades of aphid resistance of 60 lily resources

圖1 百合資源5個抗蚜等級分級標準Fig.1 Five aphid-resistance grading standard in lily

續(xù)表2

2.2 百合種質資源SSR位點多樣性分析

利用6對引物（見圖3）在60份資源中共檢測出35個等位基因，平均每對SSR引物擴增出5.8個主要等位變異，其中LS34擴增出等位變異最多，為9個。主要等位基因頻率為0.1667～0.6250，平均0.3872。多態(tài)性信息含量（PIC）變幅介于0.5663～0.8940，平均0.7472，PIC最大標記為LS34，最小標記為LS15。6個位點PIC值均大于0.5，為高度多態(tài)性位點。基因多樣性指數(shù)（H）變化為0.491～0.848，平均0.647，其中LS41最低，LS34最高。Shannon多 樣 性 指 數(shù) 為1.3759～2.5319，平 均1.9231，最高為LS34，最低為LS15（見表3）。基因多樣性指數(shù)、多態(tài)性信息含量、Shannon信息指數(shù)呈正相關，可反映每對標記鑒別能力。6個SSR位點多態(tài)性豐富，可檢測到不同百合資源間豐富的遺傳多樣性。

圖3 引物LS08 HEX在‘Starlight Express’（a）和‘Navona’（b）測序峰值Fig.3 Sequencing peak of‘Starlight Express’and‘Navona’with primer LS08 HEX

表3 6對SSR標記遺傳參數(shù)Table 3 Genetic parameters of the six SSR markers used in this study

2.3 百合種質資源遺傳多樣性分析

利用6對引物分析不同抗蚜組百合資源遺傳多樣性（見表4），不同抗蚜組百合基因多樣性指數(shù)、多態(tài)性信息含量、Shannon信息指數(shù)變化分別為0.538～0.852、0.795～0.908、0.861～1.883，平均值為0.722、0.876和1.346，其中高抗組百合遺傳參數(shù)最高。說明高抗組百合遺傳多樣性較豐富，可從中挖掘優(yōu)良基因用于品種改良。

表4 不同抗蚜組百合遺傳多樣性分析Table 4 Genetic diversity analysis of lily with different aphid resistance groups

利用Popgen 32計算不同抗性組百合種質間遺傳相似性（見表5），結果表明，遺傳距離變化為0.1309～0.5403，平均0.3306，遺傳一致度變化為0.5826～0.8773，平均0.7267。其中，感蟲組和高感組遺傳距離最小（0.1309），遺傳一致度最大（0.8773），親緣關系較近。抗蟲組和中抗組遺傳距離最大（0.5403），遺傳一致度最小（0.5826），親緣關系較遠。

表5 不同抗性組百合資源遺傳一致度和遺傳距離Table 5 Genetic identity and genetic distance of lily with different aphid resistance groups

基于UPGMA對不同抗性組百合資源聚類（見圖4），將5個抗性組劃分為3個組群（組群Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）。

圖4 基于遺傳距離不同抗性組百合資源聚類結果Fig.4 Cluster result of lily with different resistance groups based on genetic distance

圖4 中組群Ⅰ將抗蟲組歸為一類。組群Ⅱ將高抗組和中抗組歸為一類。組群Ⅲ將感蟲組和高感組歸為一類。聚類結果與遺傳相似性分析結果一致，也進一步表明百合對蚜蟲抗性與百合遺傳背景間存在密切聯(lián)系。

基于UPGMA對不同百合資源聚類（見圖5），高抗、中抗、高感資源在3個組群中均有分布，抗蟲資源主要分布在A組，感蟲資源主要分布在A和B組。基于各抗感資源間遺傳關系及距離，可為百合抗蚜育種提供更加詳細參考。

圖5 基于熒光SSR分子標記的60份百合資源聚類結果Fig.5 Cluster result of 60 lily resources based on data from SSR markers

3 討論與結論

3.1 百合資源抗蚜性評價

本研究采用抗蚜性評價方法是蚜量比值法，在作物中具有通用性，可對不同作物間抗蚜水平開展橫向比較。何俊平等鑒定32份切花菊抗蚜蟲性，研究表明10個為高抗品種，占比31.25%，14個為不抗品種，占比43.75%[1]。王仕偉等鑒定222份玉米自交系蚜蟲抗性，篩選出15份高抗蚜蟲自交系，占比6.76%，35份高感蚜蟲自交系，占比15.77%[18]。Zhang等鑒定21份西瓜資源抗蚜性，獲得2份中抗資源，占比9.52%，3份高感資源，占比14.29%[19]。本研究鑒定72份百合資源抗蚜性，獲得高抗資源31份，占比43.06%，12份高感資源，占比16.67%。可看出，百合抗蚜性水平高于其他作物。蚜蟲脅迫受氣候環(huán)境影響較大，為更加準確評價百合資源抗蚜性，需充分考慮不同年份對百合資源抗蚜差異的影響。周俐宏等對31份百合資源開展抗蚜性分級[9]，在隨后兩年重復評價中，有23份資源抗性水平表現(xiàn)穩(wěn)定，8份資源抗性水平表現(xiàn)不穩(wěn)定（已舍棄）。本研究開展連續(xù)3年重復評價，60份資源為抗性表現(xiàn)穩(wěn)定（野生）品種，增強研究結果可靠性。

優(yōu)異抗性資源是植物抗蟲育種基礎[20]。本研究中，細葉百合、有斑百合、條葉百合、岷江百合、朝鮮百合、大花卷丹為對蚜蟲有一定抗性的野生種。據文獻記載，細葉百合、朝鮮百合、大花卷丹、條葉百合均為亞洲百合雜種系親本材料[17,21-22]，直接證明抗蚜百合類型中亞洲百合占主導地位（見圖2）。而岷江百合作為喇叭型百合雜種系主要親本材料[17,23]，也增加部分OT類型百合抗蚜性（見圖2）。

3.2 百合SSR位點及抗蚜種質資源遺傳多樣性分析

Lee等基于百合屬EST數(shù)據庫開發(fā)首批百合SSR標記，利用19個標記在84份材料中檢測到188個等位變異，平均每個標記等位變異數(shù)為9.95個，平均PIC為0.76[24]。Yamamoto等利用8個SSR標記檢測236份L.auratumvar.auratumLindl.和L.auratumvar.platyphyllumBaker百合在日本不同地區(qū)遺傳多樣性，平均每個位點檢測到2.80～4.86個等位變異，平均Nei氏遺傳多樣性為0.49～0.58[25]。本研究選用6對SSR引物分析60份不同抗蚜能力百合資源，多態(tài)性信息含量為0.5663～0.8940，平均0.7472，按照Botstein等提出衡量指標[26]，當PIC＞0.5時，該位點為高度多態(tài)位點，試驗所用6對SSR引物均為高度多態(tài)位點。本研究所用SSR標記與前人研究結果相比表現(xiàn)較高遺傳多樣性，這與本試驗引物經兩次篩選，引物多態(tài)性高和熒光SSR標記檢測分辨率更高、準確性更好有關，這些位點較好反映不同抗蚜級別百合資源遺傳多樣性。

劉冬云利用12對SSR引物分析25個細葉百合居群遺傳多樣性，結果表明，野生細葉百合居群在分子水平上表現(xiàn)豐富遺傳多樣性[27]。楊敏利用6對SSR引物分析長江中游地區(qū)野生百合種質資源遺傳多樣性，結果表明，長江中游地區(qū)百合野生種遺傳分化程度較高[28]。葛亮等利用19對ESTSSR引物，將百合22個原生種和74個品種分為兩個類群[13]。Lee等利用SSR和IRAP標記分析來自韓國、中國和日本二倍體和三倍體卷丹群體遺傳多樣性，結果表明，同源三倍體卷丹來源于小數(shù)量二倍體卷丹種[14]。國內外開展百合遺傳多樣性和群體結構分析較多，本研究比較5個抗蚜等級百合資源遺傳多樣性，不同抗蚜等級百合資源蘊含比較豐富遺傳變異，顯示較高水平基因多樣性。不同抗蚜組百合資源間遺傳多樣性水平存在一定差異，高抗蚜組百合遺傳多樣性高于其他抗性組。聚類分析結果表明，高抗蚜組百合并不獨立成群，在各組群中分布一致，這也與百合高度雜合基因特性有關。高抗蚜百合具有更高遺傳多樣性，可為百合抗蚜新品種選育過程中挖掘優(yōu)良基因和拓寬遺傳基礎提供重要價值。

3.3 百合抗蚜育種親本選擇推測

利用百合資源遺傳多樣性和親緣關系，可為從百合種質資源中高效發(fā)掘有利基因/QTL提供參考，達到育成有效抵御各種生物、非生物脅迫等新品種的目的。對觀賞百合抗蚜育種來說，親本選配標準不僅要考慮親緣關系遠近，還綜合考慮親本抗蚜能力及觀賞性。抗蚜觀賞百合育種親本選配的依據是選用綜合性狀優(yōu)的抗蚜百合和生態(tài)型相近或相同，但無親緣關系廣泛應用的商業(yè)品種雜交，可獲得良好效果。本研究分析百合資源抗蚜性鑒定和遺傳關系結果可為百合抗蚜育種提供參考。例如，可選擇綜合性狀較優(yōu)的抗蚜百合‘Prato’‘White Heaven’‘Fangio’等與觀賞價值較高的‘Navona’‘Corcovado’‘Cocossa’雜交培育抗蚜切花百合；可選擇綜合性狀較優(yōu)的盆花抗蚜百合‘After Eight’與觀賞價值較高的‘Pink Palace’雜交培育抗蚜盆花百合。此外，作為中國傳統(tǒng)食用百合的蘭州百合和卷丹均為高感蚜百合種，急需改造。結合百合資源間遺傳關系（見圖4），可用高抗細葉百合改造蘭州百合，抗蚜條葉百合和朝鮮百合改造卷丹。