基于3,5-二硝基水楊酸比色法探究蘋果中可溶性糖測定方法及其含量*

高貫威，匡立學，李銀萍，李 靜，李海飛，徐國鋒

（中國農業科學院果樹研究所，農業農村部果品質量安全風險評估實驗室（興城），農業農村部果品及苗木質量監督檢驗 測試中心（興城），遼寧興城125100）

可溶性糖是衡量水果及其制品風味品質的重要指標[1-2]。果品中可溶性糖以葡萄糖、果糖和蔗糖為主[3-5]，但其構成在不同水果中存在差異。根據主要可溶性糖的種類不同，水果可分為果糖積累型和蔗糖積累型[6]。蘋果是我國第一大水果，其產量和消費量均居我國園林水果首位[7-8]。蘋果中可溶性糖是其甜度和風味品質的關鍵因素[9]，且以果糖為主，其次是蔗糖和葡萄糖[10]。蘋果中可溶性糖組分和含量的研究已有報道[11-13]。然而，其組分間定量關系的探討比較欠缺。另外，研究表明，蘋果中可溶性糖含量與其可溶性固形物含量之間呈極顯著正相關[10]。二者均是決定水果風味的關鍵性因素[6]，是水果品質的重要監測指標。

《水果及制品可溶性糖的測定 3,5-二硝基水楊酸比色法》[14]（以下簡稱3,5-二硝基水楊酸比色法）在水果可溶性糖檢測工作中的應用非常廣泛。此方法測定原理是將可溶性非還原糖進行酸化，并轉化為還原糖，堿性條件下與3,5-二硝基水楊酸反應生成棕紅色的氨基化合物，該氨基化合物在540 nm 波長下有特定吸光值。然而，3,5-二硝基水楊酸比色法中存在一定的不確定表述，易造成人們對測定結果產生異議。比如，水浴加熱后的試樣是否冷卻再加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀，方法中并未指明。另外，為保證反應的堿性條件，試樣中逐步加入氫氧化鈉（NaOH）溶液至溶液呈“淺橙色”（甲基紅試劑）。然而，淺橙色的判斷易因人而異。

本研究探究了3,5-二硝基水楊酸比色法中不確定因素在可變范圍內對可溶性糖檢測結果的影響，降低了蘋果中可溶性糖測定結果的異議。另外，本研究采用優化后的方法測定了100 個蘋果樣品中可溶性糖含量，并根據NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定 折射儀法》（以下簡稱NY/T 2637—2014）[15]測定了其可溶性固形物含量，為蘋果中可溶性糖和可溶性固形物含量分析提供了數據支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品

蘋果樣品均來自農業農村部果品及苗木質量監督檢驗測試中心（興城）。

1.2 可溶性糖和可溶性固形物含量的測定

可溶性糖含量按照NY/T 2742—2015 標準中的步驟測定，可溶性固形物含量采用 PR-101α 數顯式全糖儀測定。

2 結果與分析

2.1 乙酸鋅和亞鐵氰化鉀

樣品經過水浴加熱后，為避免樣品中的蛋白質影響糖的測定，加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液，將蛋白質沉淀。然而，樣品是否需要冷卻，3,5-二硝基水楊酸比色法未進行準確表述。為驗證亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液加入時間，將相同蘋果樣品水浴加熱，并在冷卻前后的樣品中均加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液，而后按照相同步驟測定其可溶性糖含量（n＝3）。測定結果表明，冷卻前后樣品中可溶性糖含量平均值分別為15.0%、14.5%，前者略高于后者。然而，二者相對偏差為3.1%，遠低于NY/T 2742—2015標準中重復性條件下2 次獨立測試結果限定的標準偏差（10%），表明亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液加入時，樣品是否冷卻對蘋果中可溶性糖含量測定值影響不大。

2.2 顏色調節

還原糖與3,5-二硝基水楊酸的反應需要堿性條件，因此樣品溶液中需要加入NaOH 溶液，并以甲基紅指示劑判定樣品酸堿度。3,5-二硝基水楊酸比色法中指出樣品溶液調節至“淺橙色”時即可滿足檢測需求。然而，溶液顏色肉眼判斷因人而異。

將相同樣品逐步提高NaOH 溶液的加入體積，分別調節至肉眼易判斷的淺紅色、橙黃色和淺黃色，并按照相同步驟測定樣品吸光度值（n＝5）。結果如表1 所示，樣液呈現淺紅色、橙黃色和淺黃色時，其吸光度值分別為0.757～0.816、0.793～0.849 和0.779～0.838。經SPSS 數據分析，顏色調節為淺紅色時，樣品吸光度值平均值為0.788（n＝5），顯著低于橙黃色樣品吸光度值（0.817）。同時，橙黃色和淺黃色樣品吸光度值之間無顯著差異（P＜0.05）。表明甲基紅指示劑指示下，需要將樣品采用NaOH 溶液調節至無明顯紅色，橙黃色或者淺黃色時（NaOH 溶液稍過量）樣品中可溶性糖檢測結果無顯著差別。

表1 調節至不同顏色時相同樣品最終吸光度值比較

2.3 葡萄糖標準物質

標準物質是樣品中目標物含量測定的衡量基準，是測定結果準確與否的關鍵。3,5-二硝基水楊酸比色法中采用葡萄糖作為標準物質，并規定葡萄糖需要干燥處理。在實際操作中，干燥環節常常被忽略。本研究將葡萄糖標準物質在80 ℃下干燥2 h，并將干燥前后標準物質配制成1 mg/mL 的水溶液，繼而分別配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的標準溶液，按照NY/T 2742—2015 中的步驟使其與3,5-二硝基水楊酸反應，并分別測定吸光度值。

如圖1 所示，干燥前后標準溶液吸光度值與濃度線性關系良好，R2均大于0.99。烘干后標準品最終吸光度值明顯高于烘干前標準品，表明長時間儲存的標準品中可能含有一定量的水分，造成標準物質純度不足，吸光度值相對較低。經計算，同一個蘋果樣品分別經干燥前后標準物質的吸光度值-濃度線性曲線計算，可溶性糖測定值前者高于后者12%（以干燥后標準物質為基準）。因此，葡萄糖標準物質的干燥對測定果品中可溶性糖含量至關重要。

圖1 烘干前后葡萄糖標準品濃度與吸光度值線性曲線

2.4 碳酸鈣（CaCO3）

已廢標準GB 6194—1986[16]標注，有機酸含量比較高的樣品中應加入0.5～2.0 g CaCO3調節樣品溶液至中性，現行標準NY/T 2742—2015 并未標注CaCO3是否加入。因此，實際操作中，檢測人員對CaCO3是否需要加入呈疑惑狀態。本研究將10 g 已勻漿蘋果樣品（n＝6）稱量至燒杯中后，加入CaCO3約1.5 g。另外，相同樣品未加入CaCO3，按照3,5-二硝基水楊酸比色法測定樣品的吸光度值。

結果表明，加入和未加CaCO3的樣品最終吸光度值（n＝6）平均分別為0.977、0.982，經過SPSS分析，二者吸光度值無顯著差異（P＜0.05）。然而，如圖2 所示，當加入CaCO3時樣品吸光度值為0.894～1.037，吸光度值波動范圍較大。同時，未加入CaCO3的樣品吸光度值比較穩定（0.975～0.995）。因此，本研究結果表明蘋果可溶性糖測定時無需加入CaCO3。

圖2 CaCO3 對蘋果樣品可溶性糖測定最終吸光度值的影響

2.5 蘋果可溶性固形物和可溶性糖含量測定

根據驗證后的方法，測定了100 個蘋果樣品中可溶性糖含量，并根據NY/T 2637—2014[15]測定其可溶性固形物含量。結果表明，蘋果中可溶性糖和可溶性固形物含量分別為8.9%～15.0%、11.5%～18.4%（圖3），與前人研究結果相近[10,17]。蘋果樣品中可溶性糖含量在可溶性固形物含量中的比重（糖固比）平均為77.8%，且二者呈顯著正相關，相關系數為0.783，與前人研究結果（0.735）相近[17]。水果中可溶性固形物含量采用PR-101α 數顯式全糖儀測定，操作簡單、數值穩定。因此，可溶性糖含量測定值出現異常時，可參考相應樣品中可溶性固形物含量測定值進行判定。

圖3 蘋果樣品中可溶性糖及可溶性固形物含量（n＝100）

3 結論與討論

本研究探究了3,5-二硝基水楊酸比色法中不確定表述，并分析了其在可變范圍內對可溶性糖檢測結果的影響。對比樣品冷卻前后加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液，二者可溶性糖測定值相對偏差為3.1%，遠低于NY/T 2742—2015 標準限定的標準偏差（10%），表明樣品冷卻前后均可加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液。

采用NaOH 溶液調節樣品顏色至淺紅色時，樣品吸光度值平均為0.788（n＝5），顯著低于橙黃色樣品（0.817），NaOH 溶液加入量較多的橙黃色和淺黃色樣品吸光度值之間無顯著差異（P＜0.05），表明測定蘋果樣品中可溶性糖時，甲基紅指示劑指示下，需要將樣品調節至無明顯紅色，NaOH 溶液稍過量對樣品中可溶性糖檢測結果影響較小。

未烘干葡萄糖標準品中可能含有一定量的水分，造成純度不足，吸光度較低。本文中，樣品經干燥前標準物質的濃度-吸光度值線性曲線計算，可溶性糖測定值偏高12%（以干燥后標準物質為基準）。因此，可溶性糖測定過程中務必定期將葡萄糖標準物質進行干燥處理。

CaCO3是否加入對蘋果樣品中可溶性糖測定結果影響不大，而且加入CaCO3時平行樣品之間吸光度值相差較大，因此可溶性糖測定過程中無需加入CaCO3。

蘋果中可溶性糖主要為果糖，其次為蔗糖和葡萄糖[10]。3,5-二硝基水楊酸比色法中，以葡萄糖（還原性糖）為標準品，并將樣品中的蔗糖酸化分解成為果糖（還原性糖）和葡萄糖。相近，已廢標準GB 6194—1986[16]中將標準品蔗糖進行酸化，使其轉化成還原性糖（果糖和葡萄糖），同時將樣品中蔗糖轉化為還原糖，依此測定水果、蔬菜中可溶性糖含量。然而，樣品中和水溶液中蔗糖轉化效率可能存在差異，果糖與葡萄糖還原效率也可能不同。水果中可溶性糖組成存在差異，多數果品以葡萄糖、果糖和蔗糖中的某一種為主[6]。因此，將葡萄糖、果糖和蔗糖在檢測儀器中分別進行測定可能是可溶性糖含量更為準確的測定方法。