采前水楊酸處理對芒果保鮮效果及其相關(guān)機理研究*

弓德強，胡美姣，高兆銀，李 敏，陳千付，黃慧俐，楊謹瑛，黃臺明，朱世江

（1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，海南海口571101）（2 華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院）（3 廣西百色市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)研究推廣中心）（4 海南省熱帶園藝產(chǎn)品采后生理與保鮮重點實驗室）

芒果（Mangifera indicaL.）是我國廣西、海南、四川和云南等熱區(qū)農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，但芒果是一種不耐貯運的熱帶水果。由于芒果果實在采前田間易受病原菌潛伏侵染，而且采后極易后熟軟化，導致芒果在采后貯運中發(fā)病而腐爛[1]。目前，生產(chǎn)上常用化學殺菌劑浸泡處理防治芒果采后病害，但增加了勞動力成本和采后損耗，同時也不利于食品安全[2]。近年來，采后病害的防控和保鮮越來越側(cè)重于從采前措施入手，其中采前利用抗病性誘導技術(shù)防控芒果采后病害已經(jīng)成為研究熱點之一。

研究表明，水楊酸（salicylic acid，SA）作為一種誘導植物抗病性的天然誘抗劑，于采前處理可提高櫻桃[3]、梨[4]、臍橙[5]、棗[6]和杏[7]等果實對采后病害的抗性，并有效保持果實的品質(zhì)，從而達到較好的防腐保鮮效果。采前水楊酸處理控制芒果采后病害也有一些研究報道。曾凱芳和姜微波[8]研究表明，采前應(yīng)用較低濃度（0.1 mmol/L）的水楊酸處理不僅能延緩‘紫花’芒果采后衰老進程，而且能有效控制芒果采后病害的發(fā)生。Sanikommu 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，采前噴施200 mg/L 水楊酸可抑制采后芒果乙烯的產(chǎn)生，從而延緩果實后熟衰老，并維持較高的果實品質(zhì)。弓德強等[10]系統(tǒng)研究了采前水楊酸處理對‘紅芒6 號’芒果采后品質(zhì)和抗病性的影響，篩選了采前水楊酸處理適宜的濃度、時期和次數(shù)，并進一步研究發(fā)現(xiàn)，采前水楊酸處理提高采后芒果果實品質(zhì)和抗病性與抗氧化酶活性的增強、膜脂過氧化程度的降低及后熟衰老進程的推遲密切相關(guān)。

近年來對采前水楊酸處理提高芒果采后抗病性與品質(zhì)機理的研究越來越多，但仍然不夠深入。本研究以‘紅芒6 號’芒果為材料，研究采前水楊酸處理對采后芒果果實品質(zhì)和抗病性的影響，并探討其與乙烯合成、果實軟化及防御酶相關(guān)基因表達的關(guān)系，以期為改進和完善水楊酸應(yīng)用于芒果防腐保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2019 年在廣西百色市田陽區(qū)百育鎮(zhèn)芒果生產(chǎn)園進行。供試芒果品種為‘紅芒6 號’，選擇生長良好、樹勢健壯、樹齡約15 年的芒果樹為試驗樹。

水楊酸為分析純（99.9%），購自Sigma 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 采前處理

處理時間為2019 年6 月3 日（即謝花后約60 d），此時果實發(fā)育已接近正常果大小。水楊酸處理濃度為40 mg/L，以清水為對照，均勻噴施于芒果果面后套上黑色紙質(zhì)果袋。處理與對照各重復3次，每次重復3 株樹。

1.2.2 采收與選果

于2019 年7 月28 日采收，芒果成熟度為七八成熟，此時果實中可溶性固形物含量為6.5%左右。挑選出大小、顏色基本均勻，無機械損傷，無明顯病斑或蟲咬的果實作為后續(xù)試驗用果。

1.2.3 接種炭疽菌與病斑直徑測定

采前水楊酸處理和對照各30 個果，分別接種芒果炭疽菌，接種炭疽菌參照弓德強等[11]的方法，并用直尺測量接種后8 d 和10 d 時果實的病斑直徑，以10 個測定數(shù)值取平均值表示病斑直徑，每處理重復3 次。

1.2.4 常溫貯藏

采前水楊酸處理和對照各120 個果，裝入帶孔的硬紙箱中，每個果箱裝入20 個果，放在溫度為22～25 ℃、空氣相對濕度為80%～90%的常溫庫中貯藏。定期調(diào)查自然發(fā)病的病情指數(shù)，測定乙烯釋放速率，并取樣測定果實硬度、內(nèi)在品質(zhì)及相關(guān)基因的表達情況。

1.2.5 自然發(fā)病的病情指數(shù)調(diào)查

在常溫條件貯藏的芒果中，采前水楊酸處理和對照各固定3 箱共60 個芒果，參照弓德強等[12]的方法調(diào)查每箱芒果常溫貯藏8 d 和10 d 時的病情指數(shù)，每處理重復3 次。

1.2.6 乙烯釋放速率的測定

采用封罐法測定第0、2、4、6、8、10、12 d時芒果乙烯釋放速率。在常溫條件貯藏的芒果中，處理和對照各固定5 個芒果放入4.5 L 的密封塑料盒中，放置在常溫條件下3 h，然后用1 mL 的注射器從盒內(nèi)吸取1 mL 氣體，通過Agilent（美國）5795型氣相色譜儀測定，每處理重復測定3 次。

1.2.7 果實硬度的測定

在常溫條件貯藏的芒果中，于第0、2、4、6、8、10 d 各取樣1 次，每次取5 個果實。果實硬度采用GY-B 型硬度計進行測定，取10 次數(shù)據(jù)平均值表示；將果肉和果皮分別切成小塊并混勻后用液氮速凍處理，并放于-80 ℃冰箱中保存，分別用于其他品質(zhì)指標測定和相關(guān)基因的表達。

1.2.8 果實品質(zhì)指標的測定

參照梁清志等[13]的方法。維生素C 含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法測定；可溶性固形物含量采用手持折光儀測定；可滴定酸含量采用酸堿中和滴定法測定，按檸檬酸的含量計算可滴定酸含量；用可溶性固形物和可滴定酸含量的相對比值表示固酸比。

1.2.9 目的基因相對表達量分析

參考Hong 等[14]的方法，用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析目的基因MiACO、MiEG、MiGLU和MiCHI的相對表達量，以ACTIN作為內(nèi)參基因。4 個目的基因和1 個內(nèi)參基因的引物序列信息見表1。將對照芒果0 d 取樣時間點的基因表達量設(shè)為1，計算各處理不同取樣時間點樣品的基因相對表達量。

表1 用于基因表達分析的引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003 軟件和DPS 數(shù)據(jù)統(tǒng)計系統(tǒng)對試驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析，利用LSD 法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前水楊酸處理對采后芒果病斑直徑和病情指數(shù)的影響

由圖1 可知，在貯藏8 d 和10 d 時，采前水楊酸處理芒果自然發(fā)病的病情指數(shù)均顯著低于對照，防治效果分別為80.95%和68.49%；采前水楊酸處理芒果接種炭疽菌后8 d 和10 d 時的病斑直徑均顯著低于對照，分別比對照降低了36.67%和23.17%。結(jié)果表明，采前水楊酸處理能夠提高采后芒果果實對炭疽菌侵染的抗性，對芒果具有良好的防腐保鮮效果。

圖1 采前水楊酸處理對采后芒果貯藏期間的病情指數(shù)和病斑直徑的影響

2.2 采前水楊酸處理對采后芒果乙烯釋放速率的影響

由圖2 可知，采前水楊酸處理芒果在貯藏期間乙烯釋放速率的變化趨勢與對照相似，呈先升高后降低的變化趨勢，采前水楊酸處理降低了采后芒果乙烯釋放速率的峰值，并使乙烯峰值的到來推遲了4 d，其中貯藏前期（0～8 d）的乙烯釋放速率顯著低于對照。結(jié)果表明，采前水楊酸處理能夠抑制芒果內(nèi)源乙烯的產(chǎn)生。

圖2 采前水楊酸處理對采后芒果貯藏期間乙烯釋放速率的影響

2.3 采前水楊酸處理對采后芒果果實硬度的影響

由圖3 可知，采后芒果在常溫貯藏中果實硬度逐漸降低，采前水楊酸處理延緩了采后芒果果實硬度的降低，其中貯藏期2～10 d 果實硬度顯著高于對照。

圖3 采前水楊酸處理對采后芒果貯藏期間果實硬度的影響

2.4 采前水楊酸處理對采后芒果品質(zhì)指標的影響

由圖4 可知，在采后貯藏過程中，采前水楊酸處理和對照果實維生素C、可溶性固形物和可滴定酸含量的變化趨勢相似，即先升高后降低。其中采前水楊酸處理和對照果實維生素C 含量均在貯藏6 d 時達到最大值，并在貯藏4～10 d，采前水楊酸處理果實維生素C 含量顯著高于對照；采前水楊酸處理和對照果實可溶性固形物含量分別在貯藏8 d 和6 d 時達到最大值，并且貯藏前期（2～6 d）采前水楊酸處理低于對照，貯藏后期（8～10 d）高于對照，差異基本達到顯著水平；采前水楊酸處理和對照果實可滴定酸含量分別在貯藏6 d 和4 d 時達到最大值，并且整個貯藏期采前水楊酸處理均顯著高于對照；對照果實固酸比在貯藏前期（0～4 d）變化平緩，6 d 后急劇升高，而采前水楊酸處理果實固酸比在貯藏前期（0～6 d）變化平緩，8 d 后略有升高，并且在整個貯藏期均顯著低于對照。

圖4 采前水楊酸處理對采后芒果貯藏期間品質(zhì)指標的影響

2.5 采前水楊酸處理對采后芒果MiACO 和MiEG表達量的影響

由圖5 可知，在貯藏前期（0～4 d），對照果 實MiACO的表達變化較緩，6 d 后開始迅速升高，8 d 時達到峰值，然后降低；而采前水楊酸處理芒果MiACO的表達變化一直較為平緩，并且在貯藏中后期（4～10 d）顯著低于對照。表明采前水楊酸處理抑制了采后芒果MiACO的基因表達。

在貯藏前期（0～4 d），對照果實MiEG的表達變化較緩，6 d 后開始迅速升高，10 d 時達到最大值；而采前水楊酸處理抑制了采后芒果MiEG的表達，整個貯藏期間一直處于較低水平，其中貯藏后期（6～10 d）顯著低于對照（圖5）。

圖5 采前水楊酸處理對采后芒果貯藏期間MiACO 和MiEG 表達量的影響

2.6 采前水楊酸處理對采后芒果MiGLU 和MiCHI表達量的影響

由圖6 可知，采后芒果在貯藏過程中MiGLU和MiCHI表達變化趨勢基本一致，均在貯藏6 d 時表達上調(diào)，達到峰值，然后降低；而采前水楊酸處理提高了MiGLU和MiCHI的表達，均在貯藏4 d時表達上調(diào)，6 d 時達到最大值，然后逐漸降低，其中貯藏期4～10 d 均顯著高于對照。

圖6 采前水楊酸處理對采后芒果貯藏期間MiGLU 和MiCHI 表達量的影響

3 討論與結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，采前噴施40 mg/L 水楊酸處理能夠顯著抑制采后芒果果實硬度的降低和維生素C 的降解，延緩可溶性固形物含量的升高過程，保持較高的可滴定酸含量，從而抑制固酸比的升高，表明采前水楊酸處理能夠推遲采后芒果果實的后熟衰老進程，從而延緩果實品質(zhì)的下降，達到防腐保鮮的目的。這與前期的研究結(jié)果基本一致[10,14]，在桃[15]、甜瓜[16]、棗[17]和葡萄[18]等果實上也有類似的研究結(jié)果。關(guān)于采前水楊酸處理延緩果實采后成熟衰老及保持果實品質(zhì)的相關(guān)機理，已經(jīng)有大量的研究報道。張帆等[19]研究發(fā)現(xiàn)，采前水楊酸處理主要通過誘導次生代謝物質(zhì)產(chǎn)生和增強清除DPPH 自由基能力來提高樹莓果實采后保鮮效果。敬媛媛等[16]研究表明，采前水楊酸處理可通過抑制纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和多聚半乳糖醛酸酶等酶的活性有效延緩甜瓜果實硬度的下降，從而延緩果實的后熟軟化進程。Sanikommu 等[9]研究結(jié)果表明，采前水楊酸處理能通過抑制芒果內(nèi)源乙烯的產(chǎn)生進而延緩芒果后熟衰老進程，從而保持較高品質(zhì)，延長保鮮期。這與本試驗的研究結(jié)果相似。ACC 氧化酶（ACO）是乙烯生物合成中的兩個關(guān)鍵酶之一，主要催化由1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）到乙烯（C2H4）的轉(zhuǎn)化過程[20]。在本試驗中，采前水楊酸處理顯著抑制了芒果ACC 氧化酶基因（MiACO）的表達，降低了果實乙烯釋放速率的峰值，并推遲乙烯峰值到來時間達4 d，表明采前水楊酸處理可通過抑制MiACO的表達進而抑制內(nèi)源乙烯的產(chǎn)生。果實軟化是芒果成熟的重要標志之一，內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶（EG）作為一種纖維素酶，在果實后熟軟化中起著重要的作用[21]。EG 是一類由多基因家族編碼的細胞壁代謝酶之一，EG 基因的表達與內(nèi)源乙烯關(guān)系密切，與果實早期成熟軟化的啟動有關(guān)[22]。在本研究中，采前水楊酸處理顯著抑制了采后芒果貯藏過程中MiEG表達水平的升高及果實硬度的降低，從而延緩了果實的后熟軟化，保持了較高的內(nèi)在品質(zhì)。可見，MiEG在芒果果實后熟軟化中起著重要的正調(diào)控作用。

水楊酸是植物抗病性的重要誘導因子，是植物體內(nèi)自身合成的一種類似植物激素的酚類化合物，能誘導多種植物對病毒、真菌及細菌病害產(chǎn)生抗性[23]。本研究結(jié)果顯示，采前水楊酸處理可顯著抑制采后接種芒果炭疽病菌的果實病斑的擴展，并且顯著降低芒果在自然貯藏條件下的病情指數(shù)。該結(jié)果與我們前期的研究結(jié)果是基本一致的[10]，表明采前水楊酸處理能夠誘導采后芒果果實產(chǎn)生抗病性，從而減輕采后果實發(fā)病的嚴重程度。采前水楊酸處理提高采后果實的抗病性與其能誘導一系列抗性相關(guān)的防御酶活性及其相關(guān)基因表達水平的提高密切相關(guān)，其中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、幾丁質(zhì)酶（CHI）和β-1,3-葡聚糖酶（GLU）是幾種重要的防御酶，相關(guān)研究報道較多。Qin 等[24]在櫻桃果實上噴施水楊酸，誘導了果實PAL、PPO 以及GLU 活性的增強。Yao 和Tian[3]研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸采前噴施和采后浸泡都能顯著增強櫻桃果實中PAL、POD 和GLU 的活性，從而提高采后果實的抗病性。Cao 等[4]研究表明，采前水楊酸處理提高‘鴨梨’果實抗病性與誘導PAL、CHI 和GLU 等酶活性的增強有關(guān)。水楊酸作為植物抗病反應(yīng)的信號分子，能誘導植物產(chǎn)生抗病性，促使多種病程相關(guān)蛋白（PRs）的表達[25]。其中GLU 和CHI 是研究比較多的2 個重要的PRs，分別屬于PR-2 和PR-3 家族[26]。Xu 等[27]研究表明，外源水楊酸處理桃果實能夠誘導CHI 和GLU 基因表達的增強，從而提高果實的抗病性。在本試驗中，采前水楊酸處理顯著增強了采后芒果MiCHI和MiGLU的表達水平，激發(fā)果實內(nèi)在的防御反應(yīng)機制，從而增強果實的抗病性，延緩采后病害的發(fā)生。

總之，采前水楊酸處理能夠提高采后芒果果實的品質(zhì)和抗病性，在生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。并且，采前水楊酸處理提高采后芒果品質(zhì)和抗病性與芒果乙烯合成、軟化相關(guān)基因表達的抑制和防御相關(guān)基因表達的增強密切相關(guān)。