脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的測定

王靜，姜凌娟

分析檢測

脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的測定

王靜，姜凌娟

（遼寧海思科制藥有限公司沈陽分公司，遼寧 沈陽 110179）

目的：建立脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液中氨基酸注射液吲哚-3-甲醛的測定方法。方法：采用HPLC法測定，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以磷酸二氫鈉緩沖液（取磷酸二氫鈉約3.9 g，加水溶解至1 000 mL，加2.9 g·L-1磷酸溶液約700 mL并以此磷酸溶液調(diào)pH值至2.3）-乙腈（88.5∶11.5）為流動相A，以磷酸二氫鈉緩沖液（pH2.3）-乙腈（65∶35）為流動相B，柱溫40 ℃，采用梯度洗脫，檢測波長298 nm。結(jié)果：在5.079 99～1 472.460 00 ng·mL-1范圍內(nèi)，吲哚-3-甲醛的濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好；該方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確度的 RSD 值分別為0%、0.70%。結(jié)論：該方法專屬性、重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度良好，可用于脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液中氨基酸注射液吲哚-3-甲醛的測定。

吲哚-3-甲醛；HPLC法；氨基酸注射液

腸外營養(yǎng)支持是維持因各種原因不能進(jìn)食或經(jīng)腸道攝入能量不足患者生命需要的必要手段。脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液主要用于不能或功能不全或被禁忌經(jīng)口/腸道攝取營養(yǎng)的成人患者，可提供營養(yǎng)支持，以維持機(jī)體氮平衡所需的氮量，碳水化合物和必需脂肪酸[1]，是臨床廣泛應(yīng)用的靜脈營養(yǎng)復(fù)合制劑。

脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液處方組成復(fù)雜，含有包括色氨酸在內(nèi)的17種氨基酸等。色氨酸屬于必需氨基酸，參與人體各項生理過程，調(diào)節(jié)機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)及免疫功能[2-7]。在貯藏過程中，色氨酸會氧化降解產(chǎn)生吲哚-3-甲醛，攝入體內(nèi)的色氨酸也會沿吲哚丙酮酸代謝通路代謝為吲哚-3-甲醛、吲哚乙酸等，對人體健康至關(guān)重要[8]。對吲哚甲醛的檢測目前報道較少，主要是液質(zhì)聯(lián)用法。通過對比美國藥典、歐洲藥典、英國藥典等收載的各種氨基酸原料的檢測方法，歐洲藥典對色氨酸雜質(zhì)的檢測相對完整，其收錄的色氨酸原料的雜質(zhì)從合成過程中引入的雜質(zhì)和降解雜質(zhì)共有12個，并對其中的雜質(zhì)A采用HPLC法檢測[9-12]。在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[13-14]，本研究進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，建立了一種專屬性更強(qiáng)的方法檢測制劑中色氨酸的降解雜質(zhì)吲哚-3-甲醛，為類似的制劑產(chǎn)品開發(fā)提供了一種有效的質(zhì)量控制和評價手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀（Agilent）、PB-10 pH計（Sartorius）、SQP電子天平（Sartorius）、吲哚-3-甲醛對照品（Sigma，批號：STBH5988）、磷酸二氫鈉、乙腈。

1.2 供試品

脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液氨基酸腔袋藥液（費(fèi)森尤斯卡比華瑞制藥有限公司，批號：80ND320）。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 操作步驟

精密量取本品2 mL，置10 mL量瓶中，以10%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取吲哚-3-甲醛對照品約12.5 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，精密量取上述溶液3 mL，置50 mL量瓶中，以10%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，作為吲哚-3-甲醛對照品貯備液；精密量取上述對照品貯備液1 mL，置10 mL量瓶中，以10%乙腈溶液稀釋至刻度，作為對照品溶液。照高效液相色譜法（中國藥典2020年版四部通則0512）測定。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（例如Inertsil ODS-3 4.6×250 mm，5 μm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱）；以磷酸二氫鈉緩沖液（取磷酸二氫鈉約3.9 g，加水溶解至1 000 mL，加2.9 g·L-1磷酸溶液約700 mL并以此磷酸溶液調(diào)pH值至2.3）-乙腈（88.5∶11.5）為流動相A，以磷酸二氫鈉緩沖液（pH2.3）-乙腈（65∶35）為流動相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫；流速為每分鐘0.7 mL；檢測波長為298 nm，柱溫40 ℃。

精密量取本品2 mL，置10 mL量瓶中，加入吲哚-3-甲醛對照品貯備液1 mL，以10%乙腈溶液稀釋至刻度，作為系統(tǒng)適用性溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，吲哚-3-甲醛峰與相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.0。精密量取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如有與吲哚-3-甲醛峰保留時間一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計算吲哚-3-甲醛含量。

1.3.2 方法學(xué)考察

1.3.2.1 專屬性

按處方配制除色氨酸以外的陰性樣品，取樣品和陰性樣品分別于酸、堿、氧化、高溫、光照條件下破壞，按照1.3.1中色譜條件與測定法測定。

1.3.2.2 線性

取吲哚-3-甲醛對照品適量，用乙腈溶解，以10%乙腈溶液稀釋制成含吲哚-3-甲醛約為

7.5 μg·mL-1的對照貯備液，分別量取對照品貯備液適量，以10%乙腈溶液分別稀釋成含吲哚-3-甲醛約為0.15、0.375、0.75、1.125、1.5 μg·mL-1的線性溶液，此5溶液及定量限濃度溶液，組成有關(guān)線性的6個濃度點(diǎn)，分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.3.2.3 溶液穩(wěn)定性

按照1.3.1中操作步驟，制備對照品溶液和供試品溶液。取對照品溶液分別于0、4、7、10、13、16、19、25、31 h取樣20 μL檢測；取供試品溶液分別于0、3、6、9、12、15、21、27、30 h取樣

20 μL檢測，記錄色譜圖，計算峰面積RSD，考察對照溶液和供試液的穩(wěn)定性。

1.3.2.4 重復(fù)性試驗

按照1.3.1中操作步驟，制備對照品貯備液和對照品溶液。精密量取本品2 mL，置10 mL量瓶中，加入對照品貯備液，用10%乙腈溶液稀釋成含吲哚-3-甲醛約為0.75 μg·mL-1的溶液，作為加標(biāo)供試品溶液，平行配制6份。精密量取對照品溶液、加標(biāo)供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算6份加標(biāo)供試品中吲哚-3-甲醛含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）。

1.3.2.5 準(zhǔn)確度試驗

按照1.3.1中操作步驟，制備對照品貯備液和對照品溶液。精密量取本品2 mL，分別置9個10 mL量瓶中，分別加入對照品貯備液0.5、1、1.5 mL，以10%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。每個濃度平行配制3份。精密量取對照品溶液、加標(biāo)供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算9份回收率和其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性

按處方配制除色氨酸以外的陰性樣品，取樣品和陰性樣品分別于酸、堿、氧化、高溫、光照條件下破壞，按照1.3.1中色譜條件與測定法測定。由圖1-圖12可見，本品在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下，破壞后產(chǎn)生的降解產(chǎn)物均對吲哚-3-甲醛的測定無干擾。

圖1 未破壞陰性樣品

圖2 酸破壞陰性樣品

圖3 堿破壞陰性樣品

圖4 氧化破壞陰性樣品

圖5 高溫破壞陰性樣品

圖6 光照破壞陰性樣品

圖7 未破壞樣品

圖8 酸破壞樣品

圖9 堿破壞樣品

圖10 氧化破壞樣品

圖12 光照破壞樣品

2.2 線性

取吲哚-3-甲醛對照品適量，用乙腈溶解，以10%乙腈溶液稀釋制成含吲哚-3-甲醛約為7.5 μg·mL-1的對照貯備液，分別量取對照品貯備液適量，以10%乙腈溶液分別稀釋成含吲哚-3-甲醛約為0.15、0.375、0.75、1.125、1.5 μg·mL-1的線性溶液，此5溶液及定量限濃度溶液，組成有關(guān)線性的6個濃度點(diǎn)，分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明，吲哚-3-甲醛進(jìn)樣濃度在5.079 99～1 472.460 00 ng·mL-1范圍內(nèi)，吲哚-3-甲醛濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為= 0.148 54-0.064 52，=0.999 9。

圖13 吲哚-3-甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 溶液穩(wěn)定性

取對照品溶液分別于0、4、7、10、13、16、19、25、31 h取樣20 μL檢測；取供試品溶液分別于0、3、6、9、12、15、21、27、30 h取樣20 μL檢測，記錄色譜圖，計算峰面積RSD，對照品溶液峰面積RSD為1.20%，供試品溶液峰面積RSD為0。表明對照品溶液在31 h內(nèi)、供試品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4 重復(fù)性

按照1.3.1中操作步驟，平行制備6份加標(biāo)供試品溶液，分別測定，計算供試品中吲哚-3-甲醛含量并計算RSD值，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。具體結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.5 準(zhǔn)確度

按照1.3.1中操作步驟，制備對照品貯備液和對照品溶液。精密量取本品2 mL，分別置9個10 mL量瓶中，分別加入對照品貯備液0.5、1、1.5 mL，以10%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。每個濃度平行配制3份。精密量取對照品溶液、加標(biāo)供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算9份回收率和其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，該方法回收率高，滿足分析測定的要求。具體結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果

3 結(jié)論

根據(jù)色氨酸的降解雜質(zhì)吲哚-3-甲醛結(jié)構(gòu)特征并參考色氨酸其他類似雜質(zhì)的檢測條件，優(yōu)選十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，磷酸鹽乙腈緩沖系統(tǒng)為色譜條件，建立了建立脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液中氨基酸注射液吲哚-3-甲醛的測定方法。

試驗結(jié)果表明，在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下，破壞后產(chǎn)生的降解產(chǎn)物均對脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液中氨基酸注射液吲哚-3-甲醛的測定無干擾，方法專屬性良好。同時方法線性范圍廣、回收率高且重現(xiàn)性好。該方法樣品前處理程序簡單，操作便捷，可用于脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液中氨基酸注射液吲哚-3-甲醛的測定。同樣也為復(fù)方氨基酸注射液中色氨酸雜質(zhì)研究提供了參考。

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Determination of Indole-3-carboxaldehyde in Amino Acid Injection of Fat Emulsion, Amino Acids(17)and Glucose(11%) Injection

,

（Liaoning Haisco Pharmaceutical Co., Ltd., Shenyang Branch, Shenyang Liaoning 110179, China）

In order to establish a method for determination of indole-3-carboxaldehyde in fat emulsion,amino acid(17) and glucose(11%)injection, HPLC was used to determine the sample by using octadecysilyl silica gel as column, sodium dihydrogen phosphate buffer（pH=2.3）and acetonitrile (volume ratio 88.5∶11.5) as mobile phase A, sodium dihydrogen phosphate buffer（pH=2.3）and acetonitrile (volume ratio 65∶35) as mobile phase B, column temperature 40 ℃,gradient elution, detection wavelength 298 nm. The results showed that the method was a good linear between the mass concentration of indole-3- carboxaldehyde and peak area at the range of 5.079 99～1 472.460 00 ng·mL-1.The RSD values of the reproducibility test and the recovery rate test were 0, 0.70%, respectively. The method has good specificity, reproducibility and accuracy, and can be used to determine the indole-3-carboxaldehyde in aminic acid injectionc of fat emulsion, amino acids(17)and glucose(11%) injection.

Indole-3-carboxaldehyde; HPLC; Aminic acid injection

2021-04-27

王靜（1982-），女，遼寧省沈陽市人，工程師（藥學(xué)），碩士，2009年沈陽藥科大學(xué)藥劑學(xué)專業(yè)，研究方向：藥品研發(fā)、生產(chǎn)。

TQ46

A

1004-0935（2021）06-0907-05