芋螺毒素Lt14a的質(zhì)量控制研究

王若男，吳赟*，張廣獻(xiàn)

科學(xué)研究

芋螺毒素Lt14a的質(zhì)量控制研究

王若男1，吳赟1*，張廣獻(xiàn)2

（1. 廣東醫(yī)科大學(xué) 科研平臺(tái)服務(wù)管理中心 廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞 523808；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

目的 建立芋螺毒素Lt14a原料藥的質(zhì)量控制方法。方法 采用高效液相色譜法檢測(cè)芋螺毒素Lt14a的含量和有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果 研究了芋螺毒素Lt14a的多項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)，初步建立了質(zhì)量控制方法，包括性狀、溶解性、水分、pH值、比旋度、折光率、有關(guān)物質(zhì)和含量測(cè)定。結(jié)論 所建立的芋螺毒素Lt14a的質(zhì)量控制方法重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

多肽；芋螺毒素；質(zhì)量控制

芋螺是一類生活在海洋中的軟體動(dòng)物，在大部分的熱帶和亞熱帶海域都有分布[1-2]。芋螺通過其毒管組織產(chǎn)生芋螺毒素，用于捕獲獵物或防御天敵。芋螺毒素是一類通常包括12～50個(gè)氨基酸殘基和1～5對(duì)二硫鍵的多肽[3-4]，它的功能極其多樣，可以選擇性地作用于各種亞型的離子通道或神經(jīng)遞質(zhì)受體，被認(rèn)為是神經(jīng)科學(xué)研究的重要分子工具和臨床治療藥物的重要先導(dǎo)化合物來源[5-6]。芋螺毒素Lt14a（MCPLCKPSCTNC）中含有13個(gè)氨基酸殘基和2對(duì)二硫鍵，最早在信號(hào)芋螺的毒管cDNA文庫被發(fā)現(xiàn)[7]。在此前的研究中，Lt14a表現(xiàn)出了良好的鎮(zhèn)痛活性，較低的急性、細(xì)胞和遺傳毒性[8-9]；靶向作用于神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs），且不會(huì)導(dǎo)致藥物依賴[10]。作為一種潛在的鎮(zhèn)痛化合物，目前Lt14a已經(jīng)進(jìn)入了臨床前研究階段。為了能夠進(jìn)一步的評(píng)價(jià)Lt14a的藥物性能，本文對(duì)芋螺毒素Lt14a原料藥的質(zhì)量控制方法進(jìn)行了研究[11-12]。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

高效液相色譜儀（Agilent 1200，美國(guó)安捷倫）；恒溫恒濕箱(上海一恒)；紫外可見分光光度計(jì)（UV-1102，上海天美）；自動(dòng)旋光儀（WZZ-2S，上海精科）；電子天平（CP225D，德國(guó)Sartorious）；pH計(jì)（PB-10，德國(guó)Sartorious）；阿貝折射儀（ZWAJ，上海上光）；卡爾費(fèi)休水分儀（梅特勒-托利多）；超純水機(jī)（PURELAB Classic，英國(guó)ELGA）。芋螺毒素Lt14a樣品（批號(hào)20190301、20190302、20190303、20190304），三氟乙酸（Sigma，色譜純）；乙腈（Sigma，色譜純），冰醋酸（分析純），二甲基甲酰胺（分析純），二氯甲烷（分析純）。

1.2 理化性質(zhì)檢測(cè)

1.2.1 外觀

取芋螺毒素Lt14a樣品置于光線明亮處通過肉眼觀察其顏色與狀態(tài)。

1.2.2 溶解性

稱取0.01 g Lt14a樣品分別溶解于去離子水、乙腈、1%醋酸溶液、二甲基甲酰胺、二氯甲烷中，觀察并記錄其溶解性。

1.2.3 水分

稱取0.1 g Lt14a樣品，置卡爾費(fèi)休水分儀中測(cè)定樣品水分。

1.2.4 pH值

稱取Lt14a樣品，加去離子水溶解，配制成0.1 mg·mL-1的溶液，測(cè)定溶液的pH值。

1.2.5 旋光度

稱取Lt14a樣品，加去離子水溶解，配制成濃度為2.0 mg·mL-1的溶液，置于自動(dòng)旋光儀中測(cè)定比旋度（以無水物計(jì)）。

1.2.6 折光率

稱取Lt14a樣品，加去離子水溶解，配制成濃度為1.0 mg·mL-1的溶液，在室溫條件下，置于阿貝折射儀中測(cè)定折光率。

1.3 有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)

稱取Lt14a樣品，配置成濃度為5 μg·mL-1的溶液。取20 μL樣品溶液進(jìn)樣高效液相色譜儀，記錄色譜圖。采用面積歸一化法計(jì)算，分別計(jì)算各批次樣液?jiǎn)我浑s質(zhì)峰和各雜質(zhì)的峰面積總和（除去溶劑峰）。

1.4 含量檢測(cè)

1.4.1 溶液配制

將批號(hào)20190301的Lt14a樣品設(shè)置為對(duì)照品，配制成質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。再分別稱取批號(hào)20190302、20190303、20190304的Lt14a樣品，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的樣品溶液。

1.4.2 線性范圍的確定

取Lt14a對(duì)照品溶液，加去離子水配制成質(zhì)量濃度依次為0.048、0.201、0.402、0.804、1.005、1.508和2.01 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別取20 μL樣品溶液進(jìn)樣高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制線性關(guān)系圖。

1.4.3 重復(fù)性檢測(cè)

取Lt14a對(duì)照品溶液，加去離子水稀釋至質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1，進(jìn)樣高效液相色譜儀，檢測(cè)5次，計(jì)算峰面積的平均值及RSD值。

1.4.4 含量檢測(cè)

以批號(hào)20190301的Lt14a樣品為對(duì)照品，通過高效液相色譜儀測(cè)定其他3批樣品（20190302、20190303、20190304）中的Lt14a含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 理化性質(zhì)

2.1.1 外觀

于光線明亮處通過肉眼觀察4個(gè)批次的Lt14a樣品，均為白色結(jié)晶性粉末，無臭無味。

2.1.2 溶解性

分別檢查L(zhǎng)t14a樣品在去離子水、乙腈、1%醋酸溶液、二甲基甲酰胺、二氯甲烷中的溶解性。具體結(jié)果見表1。在室溫條件下，Lt14a在水和1%醋酸溶液中易溶，在二甲基甲酰胺中溶解，在乙腈和二氯甲烷中不溶。

表1 芋螺毒素Lt14a在不同溶劑中的溶解性

2.1.3 水分

4個(gè)批次的Lt14a樣品的水分檢測(cè)結(jié)果見表2。各批次之間水分含量均勻且均不大于8%。

表2 4個(gè)批次Lt14a樣品的水分檢測(cè)結(jié)果

2.1.4 pH值

4個(gè)批次的Lt14a樣品的pH值檢測(cè)結(jié)果見表3。4個(gè)批次的Lt14a樣品水溶液的pH值都在3.4～3.5之間，呈弱酸性。

表3 4個(gè)批次Lt14a樣品的pH值檢測(cè)結(jié)果

2.1.5 旋光度

4個(gè)批次的Lt14a樣品的旋光度檢測(cè)結(jié)果見表4。由結(jié)果可知，Lt14a的平均旋光度為-26.4，為左旋性藥物。

表4 4個(gè)批次的Lt14a樣品的旋光度檢測(cè)結(jié)果

2.1.6 折光率

4個(gè)批次的Lt14a樣品的折光率檢測(cè)結(jié)果見表5。Lt14a的平均折光率為1.333。

表5 4個(gè)批次的Lt14a樣品的折光率檢測(cè)結(jié)果

2.2 有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)

通過高效液相色譜法分別記錄了4個(gè)批次的Lt14a樣品的色譜圖，采用面積歸一化法計(jì)算得到了每批次樣品中的總雜質(zhì)和最大單一雜志的百分率。由表6中的結(jié)果可見，Lt14a樣品的總雜質(zhì)含量都小于2%，最大單一雜質(zhì)含量都小于1%。

表6 4個(gè)批次的Lt14a樣品的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

2.3 含量檢測(cè)

2.3.1 線性范圍的確定

根據(jù)1.4.2的方法，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制的含量檢測(cè)線性關(guān)系圖如下圖1。最終獲得的線性方程為：=100 20.49+83.15，相關(guān)系數(shù)=0.999 82 (=7)。結(jié)果表明，Lt14a在0.048～2.01 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

根據(jù)1.4.3的方法，檢測(cè)質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的Lt14a對(duì)照品的高效液相色譜重復(fù)性。5次檢測(cè)的峰面積值分別為5 124.7、5 089.6、5 133.1、5 104.5、5 176.0，峰面積平均值為5 131.4，RSD為0.87%。重復(fù)性非常好。

2.3.3 含量檢測(cè)

根據(jù)以上的結(jié)果，以批號(hào)20190301的Lt14a樣品為對(duì)照品，通過高效液相色譜法檢測(cè)其他3批樣品（20190302、20190303、20190304）中的Lt14a含量，檢測(cè)結(jié)果見表7。從結(jié)果中可見，3批樣品中Lt14a質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%，符合原料藥含量的相關(guān)規(guī)定。

3 結(jié) 論

本研究根據(jù)國(guó)家法規(guī)對(duì)原料藥的相關(guān)要求，研究了芋螺毒素Lt14a的多項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)，初步建立了質(zhì)量控制方法，包括性狀、溶解性、水分、pH值、比旋度、折光率、有關(guān)物質(zhì)和含量測(cè)定，可以很好地控制芋螺毒素Lt14a的產(chǎn)品質(zhì)量，樣品檢測(cè)結(jié)果均在期待的限度內(nèi)，表明芋螺毒素Lt14a的質(zhì)量可控。

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Study on the Quality Control of Conotoxin Lt14a

1,1,*,2

（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Medical Molecular Diagnostics, Scientific Research Platform Service Management Center, Guangdong Medical University, Dongguan Guangdong 523808, China; 2. School of Fundamental Medical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou Guangdong 510006, China）

In order to establish the quality control method of conotoxin Lt14a, the content and related substances in Lt14a were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Several quality indexes of Lt14a were studied, and the quality control method was established, including character, solubility, moisture, pH value, specific rotation, refractive index, related substances and content. The results showed that the established quality control method of Lt14a had good repeatability, and results were accurate and reliable.

Oligopeptide; Conotoxin; Quality control

廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金聯(lián)合基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2020A1515111040）；廣東醫(yī)科大學(xué)科研基金自然科學(xué)類面上培育項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：GDMUM2020016）。

2021-04-09

王若男（1991-），女，山西運(yùn)城人，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)和生物化學(xué)。

吳赟（1987-），男，助理研究員，博士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)與多肽生物化學(xué)。

TQ464.7

A

1004-0935（2021）06-0757-03