離子色譜-脈沖安培法檢測食品中功能性低聚異麥芽糖

徐佳佳，劉玉峰，孔凡華，喬子純，崔亞娟，徐錫媛，鄭曉瑋，李 東

（北京市營養源研究所，北京 100069）

低聚異麥芽糖（Isomaltooligosaccharide，簡稱IMO）以淀粉或淀粉質原料，經酶法轉化、精制、濃縮等工藝制得的一種淀粉糖產品，分子中至少含有一個葡萄糖分子間以α-1,6 糖苷鍵結合的異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖，以及其他四糖以上的低聚糖的總稱，是近些年發展速度較快的一種功能性低聚糖[1?6]。商品低聚異麥芽糖產品規格主要有兩種，IMO-50 型和IMO-90 型[7]。低聚異麥芽糖屬于非消化性低聚糖類，難以被胃酶消化，具有水溶性膳食纖維功能，其熱量低，基本上不增加血糖血脂，有助于維持腸道菌群平衡，改善腹瀉與便泌，預防齲齒，提高機體免疫力[8?10]。鑒于低聚異麥芽糖的特性和保健功能，其已被日益廣泛應用于保健品、食品、醫藥、化妝品等領域[11]。食品中加入低聚異麥芽糖對促進人體健康具有重要意義，一定程度上降低肥胖、糖尿病、冠心病等癥的發病率。

糖類的檢測方法主要有比色法[12]、毛細管電泳法[13]、色譜法[4,14?28]、滴定法[16]等。其中色譜技術是目前所廣泛應用的檢測糖的方法。目前，低聚異麥芽糖的測定方法主要有高效液相色譜法[4,14?17]、氣相色譜法[18?19]、離子色譜法[20?28]等。高效液相色譜法受示差檢測器的影響，靈敏度較低；氣相色譜分離效果好，靈敏度高，但樣品前處理步驟復雜，一般需要對目標物進行硅烷化反應，離子色譜法測定糖具有樣品前處理簡單，無需衍生，且專一性強、靈敏度高的特點，其用于測定糖類逐漸被關注[29?32]。糖能夠在pH≥12 的堿性環境中解離成陰離子，在電極上發生氧化還原反應，用陰離子交換柱進行分離后，可以用脈沖安培檢測器檢測[10]。本研究樣品經水溶解提取，酸沉淀蛋白后，采用離子色譜-脈沖安培檢測器測定低聚異麥芽糖，以期為監管政策的落實和實施提供必要的技術支持和有力保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

異麥芽糖對照品（純度97.0%）東京化成工業株式會社；異麥芽三糖對照品（純度97.0%）東京化成工業株式會社；潘糖對照品（純度99.0%）、50%氫氧化鈉溶液（色譜純）Sigma公司;磺基水楊酸（優級純）天津市光復精細化工研究所；甲醇（色譜純）

Fisher公司；ON GUARD ⅡRP柱（3cc）美國ThermoFisher公司；0.45 μm水系濾膜 天津津滕公司；實驗室用水 Aquaplore 2C超純水；實驗所需樣品 購于北京各大超市。

ICS-3000 離子色譜儀 美國ThermoFisher公司，配脈沖安培檢測器金工作電極，Ag/AgCl參比電極；KQ-500DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；ME235s電子天平 精度0.1 mg，德國賽多利斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 9 種糖混合標準儲備溶液的配制：分別準確稱取50 mg（精確至0.1 mg）的異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖對照品到50 mL容量瓶中，用超純水配制成濃度約為1000 mg/L標準儲備液，放置4 ℃密封可保存1 個月。

9 種糖混合標準工作溶液的配制：準確吸取9 種糖混合標準儲備液1.0 mL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，為9 種糖標準使用溶液。分別準確吸取9 種糖使用溶液1、2、3、5、10、20 mL于50 mL容量瓶中，用水定容。得到標準曲線工作液濃度分別為0.8、1.6、2.4、4.0、8.0、16.0 mg/L，用時現配。

冰醋酸水溶液（0.05 mol/L）：準確吸取600 μL冰醋酸于水中，用水定容至50 mL，混勻。

1.2.2 樣品處理

1.2.2.1 采樣和試樣制備 固體樣品：抽取有代表性的樣品，用四分法縮減取200 g，粉碎后過篩，混勻，裝入自封袋中，備用。

液體樣品：混勻，備用。

1.2.2.2 提取 稱取0.5～5.0 g（精確至0.001 g）的制備好的樣品于100 mL容量瓶中，加入80 ℃左右的熱水40 mL，超聲提取15 min，冷卻至室溫后，加入20 mL3%磺基水楊酸溶液并用水定容至100 mL，充分混勻后，靜置15 min。溶液經濾紙過濾，濾液依據標準曲線的線性范圍確定稀釋倍數，備用。

1.2.2.3 凈化 凈化柱ON GUARD Ⅱ RP柱的活化按照以下步驟操作：將ON GUARD Ⅱ RP柱使用前依次用10 mL甲醇、15 mL超純水進行活化，活化液體流速控制在3 mL/min，放平，靜置20 min后使用。

取上清液依次通過0.45 μm水相濾膜和凈化柱，棄去前面3 倍柱體積洗脫液，收集后面的洗脫液待測。

1.2.3 離子色譜條件 賽默飛CarboPacTM PA20色譜柱（4.0 mm×150 mm，10 μm），CarboPacTM PA20 保護柱（4.0 mm×50 mm，10 μm），流動相：A為去離子水、B為200 mmol/L氫氧化鈉溶液；流速：0.4 mL/min，進樣體積：10 μL，柱溫:30 ℃（表1）。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The program of gradient elution

1.3 數據處理

色譜結果積分處理采用Thermo Chromenleon 6.8 SR14 色譜工作站，并利用Excel軟件進行數據統計及數據分析。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理的優化

食品中基質復雜，不僅會對目標色譜峰產生干擾，而且容易對色譜柱及檢測器造成損壞。因此，樣品前處理過程中使用了凈化柱，目的是去除試樣溶液中的色素、少量的大分子物質、脂類等，以保護分析柱，常用的凈化柱有ON GUARD A柱，ON GUARD Na柱，ON GUARD Ⅱ RP柱等。A柱主要用于去除樣品溶液中的陰離子污染物并中和強酸；Na柱主要用于去除樣品溶液中的金屬離子；RP柱主要用于去除樣品溶液中的疏水性物質及表面活性劑[33]。考慮到樣品中可能存在部分脂溶性物質，本實驗選用了ON GUARD Ⅱ RP柱，選取果粒飲料、西梅飲料、酵素、谷物棒、配方奶粉作為實驗樣品，對ON GUARD ⅡRP柱對目標物的回收率做了考察，異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖的平均回收率分別為99.31%、99.85%、99.54%，回收率均達99%以上，因此實驗確定選用該凈化柱。

此外，在樣品前處理過程中增加除蛋白的步驟以減少對結果的干擾[33]。常見的除蛋白的方法有鹽析法[28]、有機試劑沉淀法[28,34]、沉淀劑法[35]、酸沉淀法[36?37]等。本實驗從樣品類型、色譜柱、淋洗液等綜合因素考慮沉淀劑的選擇及適用性。鹽析法需加入大量鹽類物質，上機前需對樣品溶液進行脫鹽處理，否則高濃度的鹽易對色譜峰的峰形及保留時間造成影響。有機試劑沉淀法操作簡單，沉淀蛋白的分辨能力高于鹽析法，但考慮到乙腈、乙醇等有機試劑揮發性較強，易對環境造成污染，故排除了有機試劑沉淀法。常用的蛋白沉淀劑有亞鐵氰化鉀-乙酸鋅，沉淀效率高，但考慮到金屬離子對離子色譜的不良影響，故不考慮沉淀劑法。綜上，本實驗采用冰醋酸沉淀法，取6 份樣品，分別加入0.05 mol/L的冰醋酸水溶液1、2、3、4、5、6 mL，考察蛋白質的沉淀情況，結果表明，加入5 mL0.05 mol/L的冰醋酸水溶液時，樣品中的蛋白質完全沉淀，因此，確定加入5 mL 0.05 mol/L的冰醋酸水溶液作為蛋白沉淀劑，沉淀效果較好且對離子色譜分析無影響。

2.2 色譜柱的選擇

實驗采用陰離子交換柱CarboPacTM PA1、PA20，比較兩種色譜柱對樣品中可能存在的半乳糖、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖的分離效果。實驗發現，色譜柱CarboPacTM PA20 樹脂基核及覆蓋在樹脂表面的鍵合季銨基團的乳膠比比色譜柱CarboPacTM PA1 小、分離速度適中，在170 mmol/L氫氧化鈉溶液濃度下，半乳糖、葡萄糖、果糖在色譜柱CarboPacTM PA20 能夠得到較好分離。色譜柱CarboPacTM PA1 也可以將9 種糖進行分離，但分離效果較色譜柱CarboPacTM PA20差且分析時間長，當樣品中乳糖含量高時分離效果不理想，綜上，色譜柱CarboPacTM PA20 相較而言具有更大優勢，因此本實驗采用色譜柱CarboPacTM PA20 進行相關測定。其中，色譜柱CarboPacTM PA20 色譜圖和色譜柱CarboPacTM PA1 色譜圖見圖1 和圖2。

圖1 CarboPacTM PA20 色譜柱色譜圖Fig.1 The chromatogramof CarboPacTM PA20 column

圖2 CarboPacTM PA1 色譜柱色譜圖Fig.2 The chromatogramof CarboPacTM PA1 column

2.3 流動相的選擇

考察了不同濃度的氫氧化鈉溶液作為流動相的色譜分離條件，結果表明，流動相中氫氧化鈉溶液濃度的高低直接影響分離效果和分離時間，提高氫氧化鈉溶液的濃度能夠縮短出峰時間，但是可能造成分離度下降，降低氫氧化鈉溶液濃度可以增加分離度，同時使分離時間延長，難以在較短的時間內使目標物得到較好的分離度，且半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖等洗脫需要的氫氧化鈉溶液較異麥芽三糖、潘糖洗脫需要的氫氧化鈉溶液低，綜合以上因素考慮，采用梯度洗脫的方式，分離度和分離時間結果滿意，樣品測定效果較好。當樣品中乳糖含量較高時，可以通過酶解法酶解乳糖或者調整梯度洗脫程序使異麥芽糖和乳糖實現較好的分離，樣品色譜圖如圖3 所示，酶解乳糖后產生半乳糖和葡萄糖，樣品色譜圖如圖4所示。

圖3 樣品色譜圖Fig.3 The chromatogram of sample

圖4 樣品色譜圖Fig.4 The chromatogram of sample

2.4 方法線性回歸方程

以目標物質量濃度（mg/L）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程和相關系數。結果表明，異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖在0.8～16.0 mg/L范圍內線性關系良好，各化合物線性回歸方程、相關系數見表2。

表2 3 個化合物的回歸方程、相關系數Table 2 Regression equations and correlation coefficients of the three compounds

2.5 方法的定量限

當進樣量為10 μL時，將異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖的色譜信號峰與基線信號進行比較，以信噪比約為10 的濃度進行定量限計算，得異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖的定量限均為0.01 g/100 g。

2.6 精密度的測定

平行稱取6 份果味飲料，按照前處理方法進行提取并上機測定。結果如表3 所示，異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖的相對標準偏差（RSD）分別為3.42%、2.34%、1.11%，均小于5%，精密度良好。

表3 精密度實驗結果（g/100 g）Table 3 The results of precision (g/100 g)

2.7 回收率的測定

平行準確稱取6 份果味飲料，按照樣品前處理方法進行提取并上機測定，取六次測定結果的平均值為目標物的本底值；準確稱取9 份1 g（精確至0.0001 g）果味飲料分別加入不同量的低聚異麥芽糖，按照樣品前處理方法進行提取并上機測定，結果見表4。結果顯示，三種低聚異麥芽糖的回收率在85.63%～105.22%之間，相對標準偏差在2.48%～4.49%之間，方法回收率良好，準確度較高。

表4 回收率實驗結果Table 4 The results of recovery

回收率公式如下：P=（X1?X0）/ m×100

式中，P：加入的標準物質的回收率；m：加入的標準物質的量；X1：加標試樣的測定值；X0：本底的測定值。

2.8 樣品測定結果

本次實驗共收集了果味固體飲料（飲料1）、西梅飲料（飲料2）、果粒飲料（飲料3）、乳酸菌飲料（飲料4）、保健果茶、蜂蜜、酵素、果凍、營養奶昔、功能食鹽、蘇打餅干、谷物棒、配方奶粉等13 種不同類型的產品，按照已建立的方法測定樣品中6 種單雙糖和三種低聚異麥芽糖的含量，結果見表5。該方法操作簡單，可行性好，專一性強，適合不同類型食品中低聚異麥芽糖的測定。

表5 不同食品中糖的含量（g/100 g）Table 5 Sugars concentration detected in different of foods（g/100 g）

3 結論

本文用離子色譜-脈沖安培檢測方法同時測定食品中半乳糖、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖，并對樣品的前處理及色譜柱和流動相的選擇進行了考察和優化、確定了梯度洗脫程序，使其可用于多種類型的食品中的九種糖的檢測。結果表明，該方法在0.8～16.0 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數r均大于0.999，異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖精密度RSD分別為3.42%、2.34%、1.11%，回收率在85.63%～105.22%之間，相對標準偏差在2.48%～4.49%之間。方法前處理簡單、分離效果好、專一性強、結果準確度高、精密度好。該方法可以為測定多種類型食品中的低聚異麥芽糖的檢測提供較為準確、可靠的分析方法，為監管政策的落實和實施提供必要的技術支持和有力保障，具有較高的實際應用價值。