紅曲霉菌混合制曲高鹽稀態發酵過程揮發性物質的變化

張 翀，雷艷平，王丹妮，胡宗忠，田玉庭,

（1.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350001；2.福建省潘氏食品有限公司，福建三明 365050）

醬油是一種歷史悠久的發酵調味品，迄今已有兩千多年歷史[1]，其釀造工藝為使用大豆或豆粕為蛋白質原料，面粉或小麥麩皮為淀粉原料，熟化后加入曲霉等微生物培養曲料，通過微生物產生的蛋白酶、淀粉酶等豐富酶系的降解作用和后期其他微生物的協同發酵下，獲得色香味俱全的優質調味品[2]。隨著中國經濟突飛猛進的發展，人們生活水平顯著提高，對醬油的品質有了更高要求，醬油工業的發酵方法經歷了從以追求生產效率高的低鹽固態發酵法為主，到以逐漸注重醬油風味品質的現代高鹽稀態發酵法為主。醬油風味品質的追求，其本質是對于醬油產品中揮發性風味物質種類和總量的追求。揮發性風味物質作為醬油風味品質的重要組成部分，對醬油的香氣和口感都有重要影響[3]。目前，國內外對醬油香氣已進行了大量研究，Steinhaus等[4]使用芳香提取物稀釋分析技術（Aroma extract dilution analysis，AEDA）研究日本醬油，認為3-甲基丁醛等13 種揮發性物質是醬油中的主要香氣物質；趙佳豪等[5]利用氣相色譜質譜聯用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）對比了中日醬油的揮發性風味物質，發現乙酸乙酯、2-苯乙醇等共17 種差異揮發性風味物質，造成了中日醬油香氣上的差異；張艷芳等[6]從低鹽固態發酵醬油和高鹽稀態發酵醬油中分析鑒定出52 種揮發性物質，并對比出1-辛烯-3-醇為低鹽固態發酵醬油主要成分，4-乙基愈創木酚為高鹽稀態發酵醬油主要成分。無論是低鹽固態發酵醬油、高鹽稀態發酵醬油，還是國內外不同的醬油，均有研究者進行了大量的研究，而對醬油發酵過程中稀醪揮發性風味物質的研究卻鮮見報道。

紅曲為曲霉科真菌紅曲霉（Monascus purpureusWent.）附著在粳米上的俗稱，一般常用于黃酒[7]、醋[8]等調味品的發酵，其發酵過程中能夠分泌輔酶Q10和洛伐他汀等抗氧化物質，具有降低血脂和預防癌癥等作用[9]。趙吉興[10]研究證明醬油中添加紅曲后紅色指數和色澤有明顯增強，陳之瑤等[11]研究認為使用紅曲制作的糖化增香曲進行醬油混合制曲能夠增加氨基態氮等理化性質，Hsiao等[12]在醬油發酵中添加紅曲霉，發現醬油的氨態氮和谷氨酸含量均有所提高。Lim等[13]利用紅曲霉固態發酵大豆，發現發酵液酚含量和清除自由基能力有明顯提高。目前對于添加紅曲后釀造風味的變化并未見有詳細研究。

本研究通過優化頂空固相微萃取的萃取參數選擇一種適用于提取和分析醬油稀醪中揮發性風味物質的萃取方法，并對添加紅曲霉菌混合制曲后的不同發酵時間段的稀醪樣品香氣成分進行分析，進一步研究紅曲釀造醬油風味物質的發酵變化，為更有效利用紅曲和提升醬油的品質提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高鹽稀態醬油稀醪（主要原料為脫脂豆粕、麩皮、水、氯化鈉等，鹽度為17%，稀醪發酵10、30、50、70、80、120、160 d；編號分別為a、b、c、d、e、f、g）由福建省潘氏食品有限公司提供，采用混菌制曲發酵（含紅曲霉菌、米曲霉）；WSD生抽醬油、MT生抽醬油 購自當地超市；2-辛醇（色譜純）購自美國Sigma公司；其他試劑 均為色譜純或分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

GC-2010-DSQ II氣相色譜-質譜聯用儀、HPINNOWAX氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）

美國Agilent公司；固相微萃取（SPME）裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（DCP）、75 μm CAR/PDMS萃取頭（CP）、65 μmDVB/PDMS萃取頭（DP）美國Supelco公司；15 mL頂空鉗口樣品瓶 上海安譜公司；DF-1 型號集熱式磁力攪拌器金壇市鑫渃實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 萃取頭篩選試驗 將醬醪取1850 mg（約1.6 mL）移入頂空萃取瓶中，添加2.0 g氯化鈉、2 μL的內標2-辛醇（10 mg/L），放入磁力攪拌轉子，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，50 ℃水浴10 min預熱，隨后將老化后的萃取頭插入頂空瓶中，推出纖維頭進行萃取，保持50 ℃恒溫水浴萃取30 min，重復3 次。篩選相似度>80%的有效揮發性物質，對50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm DVB/PDMS三種萃取頭萃取醬油稀醪30 d的揮發性物質進行分析比較。

1.2.2 單因素實驗 以總峰面積和主要揮發性物質（A：乙酸；B：正己醇；C：2-壬基酮；D：3-呋喃甲醇；E：苯乙醇；F：2-甲氧基苯酚；G：3-甲基丁酸；H：2-甲基丙酸；I：2-甲氧基-4-乙烯基苯酚；J：2/3-甲基丁醇乙酸酯）的相對峰面積（即每個考察點相對于第一個考察點峰面積的相對百分數，如氯化鈉添加量1.0 g的相對峰面積為100%）確定該萃取頭頂空固相微萃取的條件。考察氯化鈉添加量（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g），萃取溫度50 ℃，萃取時間30 min；考察萃取溫度（40、45、50、55、60 ℃），氯化鈉添加量1.5 g，萃取時間30 min；考察萃取時間（10、20、30、40、50 min），氯化鈉添加量1.5 g，萃取溫度50 ℃；最后在最佳萃取條件下對醬油稀醪不同時期中的揮發性風味物質進行分析。

1.2.3 GC-MS分析 毛細管色譜柱：HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：高純度氦氣，柱流量：1 mL/min，不分流進樣；進樣口溫度：250 ℃；離子源：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質量掃描范圍m/z 33～500；ACQ方式 Scan MS，接口溫度250 ℃，連接桿溫度150 ℃。

程序升溫：起始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升至 220 ℃，保留8 min；后運行溫度240 ℃，后運行時間5 min。

1.3 數據分析

定性方法：將測得物質譜圖與 NIST11 和Wiley中標準譜圖進行檢索對比，并與相關文獻報道的揮發性物質描述和保留指數相比較，確證所檢出紅曲醬油中香氣物質的各種化學成分。

定量方法：采用半定量方法，添加 2 μL 2-辛醇（10 mg/L）作為內標，再利用被測物與內標物面積的比值來計算各種揮發性風味物質的質量濃度。

采用Excel 2016 對數據進行初步的分析整理，使用Origin 2017 軟件和R軟件繪制熱圖（Heatmap）進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 最佳萃取頭選擇

本實驗比較了50/30 μm CAR/ DVB/PDMS萃取頭（CDP）、75 μm CAR/PDMS萃取頭（CP）、65 μm DVB/PDMS萃取頭（DP）在頂空固相微萃取（HSME）中對萃取揮發性成分的影響。由圖1 萃取頭的質譜圖可知，三種萃取頭之間萃取效果具有顯著差異，萃取頭DP萃取物質相較于萃取頭CP和萃取頭CDP，物質種類和總量皆明顯少于后兩種萃取頭，萃取頭CP與CDP相比出峰數量較為接近。

圖1 不同萃取頭質譜圖Fig.1 Mass spectra of different extraction heads

由圖1 可知萃取頭CP萃取得到54 種揮發性化合物，萃取頭CDP萃取得到56 種揮發性化合物，萃取頭DP萃取得到48 種揮發性化合物，說明萃取頭CP和CDP在萃取效果具有相似水平，且優于萃取頭DP。從不同萃取頭萃取物質的總質量來看，可初步看出萃取頭CP的萃取效果則明顯優于其他兩種萃取頭。進一步通過主成分分析法（PCA）對萃取頭萃取數據進行分析，結果如圖2 所示。第一主成分（PC1）貢獻率占52.5%，第二主成分（PC2）貢獻率占37.1%，累計達89.6%，符合主成分分析的要求，能夠包含大部分原始變量信息[14]。

圖2 不同萃取頭主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of different extraction heads

由圖2（主成分分析圖）可知，含有DVB涂層的萃取頭DP和CDP落在PC1 的負半軸部分，而萃取頭CP落在PC1 軸的正半軸。從PC2 軸上看，萃取頭CDP在正半軸，萃取頭CP和DP在負半軸上。說明三種萃取頭萃取的揮發性化合物種類和濃度具有顯著差異。

由圖3（載荷圖）可知，分子量較大的大多處于PC1 的負半軸，如2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、苯乙酸甲酯、2,6-二甲氧基苯酚、2-苯乙酯乙酸、苯乙酸乙酯、2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚、2,4-雙（1,1-二甲基乙基）苯酚等芳香族和雜環類大分子物質，說明萃取頭DP和CDP對此類物質具有較強的吸附能力。這是因為萃取頭中的DVB涂料中的苯環由于相似相溶原理，對芳香族和雜環類物質具有更強的萃取能力。同時由載荷圖可知，小分子化合物（No.1～23）除乙酰胺（No.2）和吡啶（No.5）位于PC1 負半軸外，其他都在正半軸，且大部分位于第四象限。說明萃取頭CP對于低分子量、低沸點的化合物具有最佳的萃取效果，這與顧苑婷等[15]的研究報道相一致。可以得出不用萃取有具備不同的萃取優點，萃取頭DP和CDP對大分子、高沸點物質萃取效果較佳，CP對于低沸點的香氣物質萃取效果較佳。

圖3 不同萃取頭主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis of different extraction heads

綜合以上分析，選取萃取頭CP作為醬醪頂空固相微萃取的最佳萃取頭進行下一步研究。

2.2 頂空固相微萃取條件優化單因素實驗

2.2.1 氯化鈉添加量對頂空固相微萃取的影響 醬油稀醪在頂空固相微萃取過程中需要加入蒸餾水對其進行稀釋，其溶液中的離子強度將會降低。頂空固相微萃取SPME萃取體系中加入氯化鈉，能夠利用溶液中鹽離子的“鹽析”作用進行增強分析靈敏度和提高萃取效率[16]。研究氯化鈉添加量對SPME萃取醬醪中揮發性物質的影響，結果如圖4 所示（以氯化鈉添加1.0 g為100%）。隨著氯化鈉添加量的增加，相對總峰面積逐漸增加，氯化鈉添加2.5 g時達到峰值，隨后相對總峰面積下降。10 種主要物質中，除物質H（2-甲基丙酸）外，其他物質的相對峰面積皆在2.5 g處達到峰面積，其中3-呋喃甲醇、苯乙醇、2-甲氧基苯酚在2.5 g處具有顯著差異（P<0.05）。說明氯化鈉的添加對SPME具有較大的促進作用，當添加量大于2.5 g時具有反作用。因此，選擇氯化鈉添加量2.5g為SPME的最適添加量。

圖4 不同氯化鈉添加量萃取物質相對峰面積對比Fig.4 Comparison of relative peak areas of extracted substances with different sodium chloride additions

2.2.2 萃取溫度對頂空固相微萃取的影響 SPME的萃取溫度對萃取體系分析物的擴散速度具有重要影響，王志娟等[17]發現在一定溫度范圍內,溫度升高促進易揮發成分到達頂空及萃取纖維層表面。因此，選擇合適的溫度在研究高鹽稀態醬油醬醅的揮發性成分具有重要意義。經研究分析，結果如圖5 所示，總峰面積的相對峰面積隨著溫度的升高而提高，40 ℃（相對40 ℃時的總峰面積為100%，下同）和45 ℃（相對于40 ℃時總峰面積的百分比102.53%）較為接近，50 ℃（120.94%）和55 ℃（123.80%）較為接近，60 ℃（133.66%）最高，說明溫度的升高能夠提高分析物的擴散速度和萃取效率。10 種揮發性化合物的相對峰面積中，物質BCDEFI遵循相對總峰面積的增長趨勢，但是物質BCDF在溫度60 ℃處出現了不正常的增長，除物質B在55 ℃處有略微下降外，BCDF均在60 ℃處突然上升；相反的，物質AHJ的相對峰面積呈現先增加后減少的趨勢，均在50 ℃出現峰值，尤其是物質HJ在溫度60 ℃處出現相對峰面積低于100%（分別為73.33%和43.65%）的情況；物質G的趨勢則是在波動，且在50 ℃（125.10%）和60 ℃（128.41%）出現較高且相接近的相對峰面積。綜合以上情況說明，溫度對不同化合物的影響程度不同，以物質C（相對分子質量142）為代表的大分子化合物在溫度較高時的釋放度增加，更快的吸附至萃取頭中，由于吸附面積的一定，產生了競爭性吸附，從而降低其他物質的待分配系數，出現相對峰面積低于100%的情況，此情況與尹建邦的研究[18]相一致。因此，從萃取揮發性物質的豐度和相對濃度的角度來選擇，把50 ℃作為最適的溫度，作為后續研究的萃取溫度。

圖5 不同萃取溫度萃取物質相對峰面積對比Fig.5 Comparison of relative peak areas of extracted substances at different extraction temperatures

2.2.3 萃取時間對頂空固相微萃取的影響 萃取時間指的是SPME時達到平衡所需要的時間，此時固相萃取頭的吸附物質相對飽和，且萃取物質的組成較為合理，過長的萃取時間會改變原本萃取物質的組成成分，并有可能吸附水蒸氣，降低萃取頭使用壽命和增加柱流失。因此，本文研究了不同萃取時間對SPME萃取高鹽稀態醬油醬醅中的揮發性成分的影響，結果見圖6（以萃取時間10 min為100%）。相對總峰面積隨著時間的增加而不斷增長，揮發性物質DEGHJ均在30 min時有最大的相對峰面積，說明此類物質達到平衡的時間為30 min較為合適。具有高沸點、低分配系數的物質I（即2-甲氧基-4-乙烯基苯酚）的峰面積在40 min之后峰面積快速增長，說明此類物質需要較長時間的萃取。寇曉琳等[19]進行的研究同樣說明，過長時間的萃取會導致高沸點物質的占比顯著增加。因而可能導致對醬醅中揮發性成分構成研究的失真。因此，本研究認為選擇萃取時間30 min較為合適，并以此作為后續研究的實驗參數。

圖6 不同萃取時間萃取物質相對峰面積對比Fig.6 Comparison of relative peak areas of extracted substances at different extraction times

綜上所述，篩選出使用75 μm CAR/PDMS萃取頭的最佳頂空微萃取條件為將醬醪取1850 mg（約1.6 mL）移入頂空萃取瓶中，添加2.5 g氯化鈉，2 μL的內標2-辛醇（10 mg/L），放入磁力攪拌轉子，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，50 ℃水浴10 min預熱，隨后將老化后的萃取頭插入頂空瓶中，推出纖維頭進行萃取，保持50 ℃恒溫水浴萃取30 min。

2.3 最佳萃取條件下紅曲醬油稀醪揮發性物質變化分析

2.3.1 紅曲醬油與其他醬油揮發性物質對比 使用上述最佳萃取條件對紅曲高鹽稀態醬油稀醪發酵160 d（HQ）、WSD生抽醬油（WSD）和MT生抽醬油（MT）進行揮發性物質分析，由表1可知，HQ種類數最多，共計58 種，其中酯類物質有15 種，酯類占比最高，為50.94%±6.67%；WSD有48 種揮發類物質，吡嗪類數量最多，為13 種，但揮發類物質中占比最高的為酚類物質；MT的數量最少，為46 種，但其種類物質較為均勻，酮類物質數量最多，為8 種，而占比最高的物質類別為醇類。已有研究證明[20]，酯類物質自身具有果香、花香、蜂蜜香等芳香氣味外，還能夠調和其他物質的刺激感和苦味，緩沖鹽的咸味，促進苯乙醇等風味物質的香氣，賦予醬油更多的風味，是醬油中的重要風味物質[21]。因此能夠認為紅曲醬油的主要揮發性物質為酯、醇、酸、酮，與市場上現有的以醇、酚為主要揮發類物質的醬油產品具有明顯差異。

表1 不同醬油揮發性風味物質類別對比Table 1 Comparison of volatile flavor compounds in different soy sauces

2.3.2 紅曲醬油發酵期物質種類含量變化 根據上述SPME最優條件實驗，對紅曲高鹽稀態醬油稀醪不同發酵時期（發酵10、30、50、70、80、120、160 d；編號分別為a、b、c、d、e、f、g）的揮發性風味物質進行分析研究，結合NIST11.0 數據庫比對和內標法計算。所有紅曲醬油稀醪中檢測分類出醇類（14 種）、酸類（7 種）、酮類（9 種）、酯類（15 種）、酚類（6 種）、醛類（3 種）、吡嗪類（3 種）、吡咯類（1 種）、烯類（1 種）、呋喃類（2 種）和其他（4 種），共11 大類，65 種揮發性物質。由圖7 可知，揮發性物質總量變化趨勢呈現波動上升，在發酵30 d和80 d出現兩個波峰，其中80 d為最高峰（312.19±39.62）μg/kg。

圖7 不同時期醬醪不同種類物質對比Fig.7 Comparison of different substances in sauce mash in different periods

對比稀醪發酵前后（a與g處）可以發現，醇類、酮類、醛類、吡嗪類、烯類和其他類的物質含量是下降的，其中，醇類的下降尤為明顯，接近50%；酸類、酯類、酚類、吡咯類和呋喃類的物質含量是增加的，其中，酯類和呋喃類物質的增加倍數接近或超過兩倍。說明在高鹽稀態醬油稀醪發酵時，揮發性物質變化主要是醇類物質的下降和酯類、呋喃類物質的生成。綜上說明加入紅曲霉對釀造醬油的揮發性風味，具有顯著作用，對改善高鹽稀態醬油的發酵工藝具有重要參考價值。

2.3.3 揮發性物質變化分析 本研究在對數據進行標準化后對數據進行聚類熱圖分析，使用HemI軟件繪制圖表，結果如圖8 所示。由圖8 可知，紅曲醬油高鹽稀態發酵50 d和80 d是揮發性香氣物質生成的關鍵時期，在此時期大量的揮發性物質具有顯著變化，且在發酵后期（80～160 d）大部分物質含量出現了增加。

圖8 不同發酵時期醬醅主要揮發性物質熱圖Fig.8 Heat map of main volatile substances in soy sauce mash at different fermentation periods

14 種醇類揮發性物質有9 種物質在不同的發酵過程中具有顯著變化，正己醇C8、2-甲基丙醇C2；苯乙醇C11、2-戊醇C5；1-辛烯-3-醇C12、苯甲醇C10、3-（甲硫基）丙醇C9、3-甲基2-丁烯-1 醇C3、正丁醇C1。醬油中的揮發性醇類物質主要兩個來源：一是原料成分；二是發酵過程中的微生物代謝，主要是人為添加酵母的發酵，包括酒精發酵、氨基酸的還原反應和生物合成，以及碳水化合物的代謝途徑[22]。可以發現，發酵前中期醇類物質形成的物質種類較少，正己醇和2-甲基丙醇含量減少，但醇類物質含量基本保持不變，說明醇類物質在稀醪發酵的前期主要為微生物的代謝，且保持相對平衡。被認為有玫瑰香氣的苯乙醇主要的增長期為發酵中期，說明該時期是酵母菌發酵降解苯丙氨酸的高活性階段[23]。正己醇一般認為來自于制曲原料中，具有一定的青草味[24]，隨著發酵時間增加，正己醇的含量逐漸減少，說明其被微生物代謝利用或參與酯化反應。在發酵后期的80 d，醇類物質含量顯著增長，主要為1-辛烯-3-醇C12、苯甲醇C10、3-（甲硫基）丙醇C9、3-甲基2-丁烯-1 醇C3、正丁醇C1 等5 種醇類物質含量的增長。李楊等[25]研究認為1-辛烯-3-醇是米曲霉孢子的特征性揮發性成分，帶有一種蘑菇的香氣，可能主要來源于大曲發酵階段。本實驗發現，在發酵后期該物質具有顯著變化，說明在發酵后期同樣能夠生成，或者說1-辛烯-3-醇的來源并非只有大曲培養階段。

醛酮類物質一般是具有令人愉悅的揮發性物質，如甜香、草香、焦香等[25]，能夠增強醬油的風味。本實驗發酵樣品中的酮類變化較顯著的分別為前期的乙偶姻T1、4-羥基-2-甲基苯乙酮T8 和中期的苯乙酮T4、異佛爾酮T2；醛類變化顯著的有前期的3-甲基2-丁烯醛Q1 和中期的苯甲醛Q3。可以發現酮類物質和醛類物質含量的主要變化集中在發酵的前中期，說明醬油稀醪發酵前中期是醛酮類生成的關鍵時期。醬油中的醛酮類主要來自氨基酸的降解、微生物發酵代謝和脂類的氧化[26]，如苯甲醛可由乳酸菌通過代謝產生，其前體物是苯丙氨酸[27]。

醬油中的雜環類物質有吡嗪、呋喃、吡咯、酚類化合物等，這些物質能夠賦予醬油特殊風味，如具有堅果香的2,5-二甲基吡嗪、煙熏味的愈創木酚和4-乙基愈創木酚等[28]。在稀醪發酵樣品中發現2,5-二甲基吡嗪B2、甲基吡嗪B1、2-甲基-3-異丙基吡嗪B3 三種吡嗪類物質的顯著變化均在稀醪發酵的前期，說明吡嗪類物質的生成主要在稀醪發酵前期，吡嗪類物質的生成是由L-抗壞血酸（ASA）與L-谷氨酸（Glu）/L-天冬氨酸（Asp）進行的美拉德反應[29]。2,3-二氫苯并呋喃N2 同樣在稀醪發酵的前期具有顯著性增長，與后期含量逐漸增多的3-呋喃甲醇N1 不同。吡咯類中2-乙酰吡咯L1 和部分酚類物質2-甲氧基苯酚（愈創木酚）F3、苯酚F1 則主要在稀醪發酵中期具有顯著變化，而2,6-二甲氧基苯酚F5、4-乙基-2-甲氧基苯酚（4-乙基愈創木酚）F4、2,4-雙（1,1-二甲基乙基）苯酚F6 則主要集中在發酵后期。據研究表明，酚類化合物是在發酵過程中通過曲霉降解和酵母發酵生成，如4-乙基愈創木酚由阿魏酸或者香草醛經酵母菌及細菌發酵生產[30]。酚類物質主要變化在發酵中后期，說明酚類物質的產生可能基于相關酸類和醛類含量以及酵母菌或細菌的數量。

在稀醪發酵液中發現的8 種酸類物質中具有顯著性變化的僅有2-甲基丙酸S3、乙酸S1、戊酸S5 這三種酸類，且集中在發酵后期，其他酸類的變化則較為穩定。其中具有干酪、奶制品香味的2-甲基丙酸S3 和酸香的乙酸S1 的含量較高[25]。乙酸是由乳酸菌對檸檬酸的分解代謝形成的[31]，說明發酵后期乳酸菌的生長代謝十分旺盛，能夠柔和醬油的口感，并與醇類物質反應生成酯類。

酯類物質在發酵中期具有顯著變化的是2-甲基丁酸2-苯乙酯Z15、β-苯基乙基丁酸酯Z14、乙酸2-苯乙基酯Z12、1-丙烯-2-醇乙酸酯Z2，后期則為 4-羥基丁酸甲酯Z7、丁酸乙酯Z4、3-甲基-1-丁醇乙酸酯Z9、甲基丁酸酯Z3、乙酸乙酯Z1、2-羥基丙酸乙酯Z6、苯乙酸乙酯Z13、苯乙酸甲酯Z11、2-甲基丁酸乙酯Z8 等。可以發現酯類物質含量基本都發生了顯著變化，特別是發酵后期，說明在發酵后期具備有利于酯類形成的物質和條件，微生物生長代謝旺盛，在酯化酶的作用下合成酯類[32]。酯化酶為胞內酶，其作用方式為催化酵母細胞內的活性酸一酰基輔酶A與醇結合形成酯或由脂肪酸和醇生物合成脂肪酸酯，如具有濃烈水果香氣的乙酸乙酯是醬油中的風味物質，由乙酰輔酶A與氨基酸或糖類降解后產生的高級醇反應生成[33]。酯類物質的含量豐富，能夠賦予醬油良好的風味。

綜合以上，可以發現醛酮類物質含量變化的主要在發酵前中期；醇類物質在稀醪發酵的整個時期均有顯著變化；雜環類物質在前中后期均有不同物質的含量增加；酸類則是只有在發酵后期具有顯著變化，尤其是乙酸和2-甲基丙酸；酯類物質在高鹽稀態發酵中后期呈現大量增長，說明增加醬油中酯類物質的含量，可通過延長醬油高鹽稀態的發酵時間，從而提升醬油的風味。此外，添加了紅曲霉菌的醬油發酵中發現酯類物質的含量和豐度均為最高，酯類作為醬油中水果香和清香的香氣主體，說明紅曲菌的添加能夠提升改善醬油風味有著重要作用，在醬油高鹽稀態發酵過程中能夠直接起到增香作用。

3 結論

通過對50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm DVB/PDMS三種萃取頭萃取進行篩選試驗，發現75 μm CAR/PDMS萃取頭對高鹽稀態紅曲醬油醬醅的揮發性風味物質具有較好的萃取效果。使用該萃取頭的最佳萃取條件為：添加2.5 g氯化鈉、萃取溫度50 ℃、萃取時間30 min。使用最佳萃取條件萃取下經頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（HS-SPME-GC-MS）檢測分析不同醬油間揮發性成分物質種類及其占比發現，紅曲醬油中揮發性物質種類高達58 種，其中酯類的占比和豐度最高。并對高鹽稀態紅曲醬油稀醪發酵不同時期樣品進行研究，發現醇類（14 種）、酸類（7 種）、酮類（9 種）、酯類（15 種）、酚類（6 種）、醛類（3 種）、吡嗪類（3 種）、吡咯類（1 種）、烯類（1 種）、呋喃類（2 種）和其他（4 種），共65 種物質。

通過熱圖分析其不同時期的增長率，紅曲醬油稀醪發酵前中期是醛酮類、吡嗪、吡咯類物質含量的生成時期；稀醪發酵中后期是酚類、酸類、酯類的顯著增加時期；僅有醇類物質是在整個發酵期間均有某種物質顯著增加。說明高鹽稀態發酵法，發酵時間對醬油風味物質的生成具有至關重要的作用。揮發類物質中酯類物質是含量和豐度最高的種類，證明了紅曲的添加對醬油的風味和品質具有顯著的增強和改善作用。建議下一步對發酵過程中微生物生長調節與紅曲醬油的風味物質的相關性和變化通路進行研究。