上調(diào)微小mRNA-564對非小細胞肺癌A549細胞生物學行為的影響研究

王艷春 李昶

肺癌是一種惡性程度較高的腫瘤，是威脅人群生命健康最大的惡性腫瘤之一[1]。近幾十年來許多的國家都報道肺癌的發(fā)病率和病死率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和病死率均占所有惡性腫瘤的第一位[2]。肺癌的發(fā)生與長期大量吸煙有著非常密切的關系，有研究表明，長期吸煙的肺癌患者比不吸煙者患上肺癌的概率是10～20倍，隨著吸煙者的年齡越小，患肺癌的概率越高[3]。城市中大量的煙塵和大氣中含致癌污染物，也是導致患上肺癌的因素之一，因此尋找一個有效治療肺癌的臨床治療具有重要意義[3]。本文研究中，上調(diào)微小信使核糖核酸-564(miR-564)對非小細胞肺癌A549細胞生物學行為的影響研究，具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料 研究細胞：非小細胞肺癌A549細胞，購于上海北諾生物科技有限公司，貨號l100800。本研究獲得我院倫理委員會批準。主要試劑：TLR-4(上海科敏生物科技有限公司)，貨號：H00007099-G01；MyD88(深圳市豪地華拓生物科技有限公司)，貨號：251418；IκBα(上海江萊生物科技有限公司)；CyclinD1(武漢博歐特生物科技有限公司)，貨號：orb77046；P21(北京百奧萊博科技有限公司)，貨號：K23376-XGJ；MTT試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)，貨號：JKSJ-1812；流式細胞儀(常州必達科生物科技有限公司)，貨號：1026；Transwell小室(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組處理:選取細胞分為空白組、下調(diào)組、上調(diào)組，空白組不做任何處理，對下調(diào)組、上調(diào)組細胞進行培養(yǎng)。取下調(diào)組、上調(diào)組2組細胞，將培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，培養(yǎng)基回溫后噴以70%的乙醇并擦拭，輕搖冷凍管2 min其全部融化，移入無菌操作臺內(nèi)。測量出細胞的濃度，將細胞種植于六孔板內(nèi)，每個六孔板大約種植細胞4×105細胞，加至新鮮的培養(yǎng)基中(10 ml)進行培養(yǎng)。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞孵育到融合率在40%～80%時，取1.5 μl的質(zhì)粒DNA溶于100 μl的雙抗培養(yǎng)基中(不含血清)，之后進行充分混合，混合均勻后進行離心處理至EP管底，在EP管中加入12 μl的PolyFectReagent，進行上下重復顛倒3次，進行混勻處理，靜置在室溫環(huán)境下，靜置時間約為3～6 min，對轉(zhuǎn)染復合物的形成起到促進作用，吸去置于六孔板中的培養(yǎng)基，將新鮮的完全培養(yǎng)基加入(10 ml)，在含有轉(zhuǎn)染復合體的EP管中加入含有血清和雙抗的600 μl完全培養(yǎng)基，上下重復顛倒2次，在加入六孔板中進行水平搖晃，以促進轉(zhuǎn)染復合物的均勻分布。培養(yǎng)24 h后進行常規(guī)的換液處理，再次繼續(xù)24 h的培養(yǎng)，使用熒光顯微鏡下對熒光亮度進行觀察，對細胞進行收集，提取細胞RNA，鑒定轉(zhuǎn)染效率，將轉(zhuǎn)染效率最高的質(zhì)粒組、空載組稀釋液接種于10 mm2培養(yǎng)皿中，選取經(jīng)過PCR驗證篩選的細胞進行消化處理后稀釋，稀釋后接種在24孔板中，最終建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的miR-564下調(diào)組、miR-564上調(diào)組。

1.2.2 細胞增殖、凋亡能力、細胞周期分布檢測:MTT法檢測細胞增殖用含有10%胎小牛血清培養(yǎng)液配單個細胞懸液，細胞按7×103個/孔接種于96孔板，每孔體積200 μl，同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)2～4 d，培養(yǎng)2～4 d 后，每孔加入MTT繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)清液。每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min。選擇570 nm波長，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸收值為縱坐標繪制細胞生長曲線。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡、周期分布，收集細胞樣本，細胞數(shù)量<10×105個。并將細胞在37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，用冷PBS洗滌細胞1次，再用200～500 μl冷PBS重懸細胞。加入200 μl PI染液，搖晃混勻后4℃，避光常溫環(huán)境中4 h，流式細胞儀檢測結(jié)果的最大激發(fā)波長為488 nm。

1.2.3 細胞侵襲檢測:使用檢測細胞侵襲能力，用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基洗細胞3次，配制細胞懸液，細胞濃度為5×105/ml，于Transwell小室的上室中加入不同的細胞懸液200 μl，每組選3個復孔，在37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，HE染色計數(shù)，在光學顯微鏡下觀察穿過膜的細胞數(shù)。

1.2.4 細胞劃痕實驗將細胞接種到6孔板中，待細胞貼壁生長，細胞增長到90%時，使用200 μl的移液器槍頭,垂直劃出3條直線。之后經(jīng)過PBS緩沖液進行清洗2～3次，分別加入0.5%的血清培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)24 h，使用光學顯微鏡觀察各組細胞的遷移變化。

1.2.5 CyclinD1、P21、TLR-4、MyD88、IκBα蛋白表達檢測:采用Western Blot檢測，使用PBS清洗細胞，測定蛋白的濃度。100℃加熱處理5 min促使蛋白變性，SDS蛋白緩沖液后電泳進行轉(zhuǎn)膜，搖床上常溫封閉1 h；采用DAB染色試劑盒顯色，光密度掃描版進行分析。

2 結(jié)果

2.1 3組細胞不同時間點增殖、凋亡能力比較 下調(diào)組在24、48、72 h,細胞增殖率均高于空白組，上調(diào)組細胞增殖率低于空白組和下調(diào)組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；下調(diào)組在24、48、72 h，細胞凋亡率低于空白組，上調(diào)組細胞凋亡率高于空白組和下調(diào)組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1，表1。

表1 3組細胞不同時間點增殖、凋亡能力比較

空白組下調(diào)組上調(diào)組

2.2 3組細胞侵襲、遷移能力比較 下調(diào)組侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)均高于空白組和上調(diào)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上調(diào)組侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)均低于空白組和下調(diào)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2，圖2。

空白組下調(diào)組上調(diào)組

表2 3組細胞侵襲、遷移能力比較 個,

2.3 3組TLR4/NF-κB通路TLR-4、MyD88、IκBα表達比較 下調(diào)組TLR-4、MyD88、IκBα表達均高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；上調(diào)組TLR-4、MyD88、IκBα表達低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；上調(diào)組TLR-4、MyD88、IκBα表達低于下調(diào)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 3組TLR4/NF-κB通路蛋白TLR-4、MyD88、IκBα表達比較

圖3 TLR-4、MyD88、IκBα表達WB圖

2.4 3組細胞周期分布情況比較 下調(diào)組細胞處于G1、S、G2期的比例低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；上調(diào)組細胞處于G1期的比例均高于空白組處于S、G2期比例低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；上調(diào)組細胞處于G1期的比例高于下調(diào)組S、G2期比例低于下調(diào)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組細胞周期分布情況比較

2.5 3組細胞周期相關蛋白CyclinD1、P21表達比較 下調(diào)組CyclinD1高于空白組，P21低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；上調(diào)組CyclinD1低于空白組，P21高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；上調(diào)組CyclinD1低于下調(diào)組，P21高于下調(diào)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 3組細胞周期相關蛋白CyclinD1、P21表達比較

圖4 CyclinD1、P21表達WB圖

3 討論

近年來我國患惡性腫瘤的人群明顯升高，肺癌的主要病理組織分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩大類，肺癌患者病理分型中絕大部分是非小細胞肺癌，給患者及其家屬帶來日常生活、生命健康等影響[4，5]。肺癌患者往往早期無癥狀或癥狀不明顯，肺癌患者一旦出現(xiàn)病癥、體征已是肺癌晚期，臨床對肺癌患者治療效果并不令人滿意，對非小細胞肺癌患者要早期發(fā)現(xiàn)，早診斷治療[6，7]。在本文研究中，上調(diào)微小RNA-564對非小細胞肺癌A549細胞生物學行為的影響，效果有顯著改善。

臨床研究顯示[8，9]，肺癌的發(fā)生與多種miRNA表達異常相關，經(jīng)調(diào)控異常表達的miRNA可抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖、侵襲、遷移，促進凋亡。微小mRNA-564屬于miRNA家族成員之一，其在臨床上被證實在肺癌中表達異常，且與肺癌疾病進展密切相關[10]。鑒于此，在本文中分析調(diào)控微小mRNA-564對肺癌細胞生物學行為的影響，結(jié)果顯示，上調(diào)mRNA-564能讓非小細胞肺癌A549細胞抑制癌細胞增殖，癌細胞凋亡率升高[11]。調(diào)控細胞周期的關鍵是G1期向S期進展，細胞中多種蛋白共同參與[12]。研究顯示，CyclinD1在G1期向S期進展中發(fā)揮著關鍵性的作用，G1期合成水平相對較高。P21通過抑制CyclinD1蛋白表達，有助于抑制癌細胞從G1期向S期進展。在本文中，上調(diào)組CyclinD1蛋白表達降低，P21蛋白表達升高，說明上調(diào)微小mRNA-564通過調(diào)控CyclinD1、P21蛋白表達，實現(xiàn)對非小細胞肺癌A549細胞周期阻滯[13]。上調(diào)miR-564阻滯細胞周期分布，在G1期，能夠讓癌細胞凋亡。上調(diào)mRNA-564阻滯癌細胞周期分布促進癌細胞凋亡有重要意義，CyclinD1能促進細胞增殖，CyclinD1通過結(jié)合并激活G1時期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，G1期周期抑制蛋白被磷酸化，磷酸化的蛋白從其所結(jié)合E2F轉(zhuǎn)錄因子起轉(zhuǎn)錄活細胞周期的基因，從而推動細胞周期有G1時期進入到S時期[14]。因此上調(diào)mRNA-564能夠阻滯癌細胞的周期，對癌細胞凋亡有一定的作用[15]。上調(diào)mRNA-564對非小細胞肺癌A549細胞的侵襲、遷移有著密切關系，在本文研究中，通過Transwell小室實驗對非小細胞肺癌A549細胞的侵襲、遷移能力進行測驗，上調(diào)mRNA-564對非小細胞肺癌A549細胞的侵襲、遷移細胞數(shù)量減少，說明上調(diào)mRNA-564能夠抑制A549細胞的侵襲、遷移的作用。A549細胞增殖、侵襲、遷移，促進凋亡與細胞通路蛋白表達變化有密切聯(lián)系[16，17]。TLR-4為氣道上皮細胞以及肺泡巨噬細胞中重要的免疫受體，可識別一系列病原體相關分子模體，通過TLR-4/MyD88依賴的信號鏈，啟動相應的免疫防御反應。MyD88是Toll樣受體信號通路中的一個關鍵接頭分子，在傳遞上游信息和疾病發(fā)生中具有重要的作用。IκBα是發(fā)現(xiàn)于成熟B細胞中的轉(zhuǎn)錄因子，具有淋巴細胞特異性，在各個細胞中均有表達。IκBα抑制肺癌細胞凋亡和阻滯細胞周期，在血管生成、細胞遷移、免疫激活等方面具有重要作用[18-20]。

綜上所述，上調(diào)微小mRNA-564經(jīng)調(diào)控TLR-4、MyD88、IκBα蛋白的表達，抑制增殖、侵襲、遷移，促進凋亡，經(jīng)調(diào)控CyclinD1、P21蛋白表達阻滯細胞周期分布。