應用多重連接探針擴增技術檢測X-性連鎖魚鱗病一家系STS基因

黨 陽 湯莊力 牛新武 耿松梅 劉 艷 王曉鵬

1西安交通大學第二附屬醫院皮膚病院，西安，710004；2浙江大學醫學院附屬第二醫院，杭州，310009

X-性連鎖魚鱗病(X-linked ichthyosis, XLI, OMIM # 308100)由Lundborg等學者在1927年首次報道[1]。XLI患者幾乎全部為男性，世界范圍內的患病率約為每1500名男性中有一例患者[2]，在所有型別魚鱗病的構成比中排第2位。

XLI患者通常在出生后數周開始出現臨床表現，但部分患者出生時即有魚鱗病皮損[3,4]。皮損初發時表現為軀干四肢廣泛分布的半透明大而細碎的鱗屑，隨著病情進展，皮損逐漸發展為典型的深色多邊形黏附性鱗片。皮損可累及四肢、軀干、頸部，褶皺部位亦可受累。此外，部分患者可同時伴有隱睪、角膜渾濁以及神經精神系統改變[5]。

XLI的致病基因為STS基因，該基因位于Xp22.31，共有10個外顯子，基因長度約為135 bp，編碼類固醇硫酸酯酶(steroid sulfatase, STS)。STS廣泛分布于包括胎盤、皮膚、陰道、乳腺、血液、肝臟、腦等人體各組織器官[6]，并被證實與XLI的發病機制相關[7]。本文報道1個呈現STS基因大片段缺失的X-性連鎖魚鱗病家系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 先證者，男，31歲。出生時系足月順產，生后生長發育同同齡兒。患者出生后2個月即出現全身皮膚干燥、粗糙，四肢伸側為著，可見大小不一的多邊形黑褐色鱗片。家系中無類似臨床表現患者。先證者父母非近親婚配。

1.2 外周血基因組DNA提取與質檢 獲取患者及其父母知情同意后，經肘正中靜脈分別采集患者及其父母外周血2 mL，EDTA抗凝，使用全血基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取基因組DNA備用。

利用ND-1000-UV-VIS波長紫外/可見光掃描分光光度儀(Nanodrop，USA)對提取的基因組DNA進行定量檢測。所提取的DNA樣本濃度應介于20～100 ng/μL之間，OD260/OD280比值以及OD260/OD230比值均應介于1.8～2之間。

1.3 多重連接探針擴增技術檢測 按照多重連接探針擴增P160-STS試劑盒(MRC，Holland)的操作說明書對所得基因組DNA樣本進行多重連接探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)。

將擴增所得的樣本使用ABI3130型基因測序儀(Applied Biosystems，CA，USA)進行測序，運用MLPA分析軟件Coffalyser對所得數據進行分析。

2 結果

患者所在家系中僅患者表現有XLI的臨床癥狀，尤其是四肢伸側可見大小不一多邊形黑褐色鱗屑(圖1)。

1a：左上肢伸側皮損；1b：左下肢股骨前側皮損；1c：患者雙下肢皮損

對患者及其父母的MLPA分析結果可知，患者STS基因各外顯子探針檢測信號均為0，提示患者為STS基因缺失半合子。患者母親STS基因各外顯子探針檢測信號均小于0.7，提示該基因全部外顯子存在雜合缺失。患者及其母親STS基因MLPA分析結果見圖2。患者父親STS基因各外顯子探針檢測信號均正常。

2a:患者STS基因MLPA結果圖，該基因各外顯子探針檢測信號均為0，提示患者為缺失半合子；2b:患者母親STS基因MLPA結果圖，該基因各外顯子的探針檢測信號介于0.49～0.55之間，均小于0.7，提示患者母親為缺失雜合子

3 討論

XLI為伴X染色體隱性遺傳性皮膚病。由于男性基因組核型為46，XY，一旦唯一的X染色體存在STS基因突變或缺失即可出現魚鱗病的典型臨床表現，而女性患者只有STS基因發生純合突變或復合雜合突變時才會表現魚鱗病的典型臨床表現，截至目前，PubMed數據庫中僅報道4例女性XLI患者[8]，患病人數遠遠少于男性。

在健康人皮膚組織，STS主要存在于角質形成細胞的內質網膜上。當STS基因發生喪失功能突變時，其編碼蛋白質結構及功能發生改變，局部膽固醇硫酸鹽脫磺化過程受阻，一方面造成局部膽固醇硫酸鹽的大量沉積，出現鱗屑等臨床表現，另一方面造成膽固醇硫酸鹽脫磺化的產物顯著減少，影響皮膚正常的屏障功能，并改變皮膚正常的pH值。異常的皮膚pH值會影響局部絲氨酸蛋白酶的活性，表皮角質層細胞間黏附性增強，進一步出現表皮角化過度的病理生理改變[9]。

STS基因位于Xp22.31區域，屬于人類X染色體上的進化層(evolutionary strata)，該區域具有低豐度的散在重復序列(interspersed repeats)以及較低的GC含量，容易發生非等位基因同源重組[10,11]。該區域的基因除了STS外還有ANOS1、NLGN4X、HDHD1、PNPLA4和VCX。ANOS1基因突變可致卡爾曼綜合征，NLGN4X和VCX基因與智力發育有關，而HDHD1和PNPLA4基因則分別與核苷酸去磷酸化以及維持表皮穩態相關[11]。本研究中的先證者在該區域發生了微缺失，造成STS以及HDHD1基因全部外顯子缺失，但HDHD1基因突變所致人類疾病至今未見報道[12]。患者母親STS基因各外顯子的探針檢測信號均小于0.7，但檢測信號略有差異，值介于0.49～0.55之間，該基因各外顯子檢測信號的微小差異可能與萊昂現象(Lyon phenomenon)有關。

XLI為伴X染色體隱性遺傳，該家系中患者的母親無兄弟，姐妹拒絕接受相關檢查，而患者的外祖父母已經過世，據其母回憶，患者的外祖父無魚鱗病的相關臨床表現，而STS基因發生原位缺失的幾率小，因而推測該缺失雜合子可能來源于先證者外婆或更久遠的親代。

Xp22.31區域微缺失造成STS基因以及HDHD1基因外顯子全部缺失在XLI較為常見，約占所有XLI患者的85%～90%[1]，STS基因堿基替換或插入缺失突變僅占本病基因改變的很小一部分。運用MLPA技術常規開展產前篩查，尤其是在有魚鱗病家族史的備孕夫妻中開展，對提高新生人口質量有較大幫助。