LINC01133靶向miR-625調控CCND1促進胰腺癌發展的機制研究

楊富蘭

由于胰腺癌的早期癥狀不明顯，因此絕大多數患者在診斷時已處于晚期，胰腺癌的高轉移潛力是影響胰腺癌預后不良的重要因素，因此，對胰腺癌轉移的分子機制進行分析是開發新治療方法的基礎[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)在腫瘤的發生和發展中起重要作用，研究顯示miR-625可通過靶向抑制其靶基因的表達在乳腺癌中發揮抑癌作用[2]。長非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度>200個核苷酸、不具有蛋白質翻譯功能的長鏈RNA。LncRNA可以通過靶向miRNA調節信使RNA(message RNA，mRNA)降解和翻譯[3]。LINC01133是新發現的一種具有促癌作用的LncRNA，在肺癌中，LINC01133水平升高并且可能與患者不良預后有關，提示LINC01133具有促進腫瘤發展的作用[4]。G1/S-特異性周期蛋白-D1(Cyclin D1，CCND1)是調控細胞增殖的重要蛋白，有研究結果也顯示CCND1具有促進腫瘤細胞遷移和侵襲的作用[5]。本文分析LINC01133通過靶向miR-625調控CCND1促進胰腺癌細胞遷移、侵襲的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 人胰腺癌細胞系SW1990(ATCC公司，美國)。DMEM培養基(Invitrogen公司，美國)。LINC01133和CCND1過表達質粒和miR-625類似物(mimic)以及相應的陰性對照(negative control，NC)(Thermo Fisher公司，美國)。Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)。雙熒光素酶報告試劑盒和相應的1000 System熒光檢測儀(Promega公司，美國)。細胞計數試劑盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)試劑盒(Beyotime生物技術研究所，中國)。Transwell小室(BD Biosciences公司，美國)。PCR引物由Genewiz公司(中國)設計和合成。Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)。逆轉錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒(Roche公司，瑞士)。ABI 7500 PCR檢測系統(Life technology公司，美國)。RIPA裂解緩沖液(Beyotime公司，中國)。BCA蛋白測定試劑盒和ECL試劑盒(北京Applygen公司，中國)。CCND1、GAPDH抗體和二抗(Abcam公司，美國)。PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 生物信息學分析 通過工具網站GEPIA分析TCGA數據庫的宮頸癌患者LINC01133水平與宮頸癌進展情況和與CCND1水平之間的關系。然后分析LINC01133與患者預后間的關系。然后預測LINC01133靶向miR-625和miR-625靶向CCND1的結合位點。

1.3 方法

1.3.1 雙熒光素酶報告實驗：將細胞分為NC組和mimic組，并分別通過質粒轉染NC-pMIR-REPORT和miR-625 mimic-pMIR-REPORT。在驗證miR-625靶向CCND1時，分別將野生型的CCND1(CCND1-wt)或突變的CCND1(CCND1-mut)克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。在驗證LINC01133時靶向miR-625時，分別將LINC01133-wt和LINC01133-mut克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。將SW1990細胞接種在6孔板中，然后使用Lipofectamine 2000分別將克隆和突變的序列轉染至細胞中。使用熒光素酶報告檢測儀評估熒光素酶活性。

1.3.2 細胞培養、分組與轉染：將SW1990細胞在DMEM培養基中培養，37℃，5% CO2，相對濕度100%。將細胞分為4組，即對照組、LINC01133組、LINC01133+mimic組和mimic組。使用Lipofectamine 2000試劑盒進行瞬時轉染，其中mimic組和LINC01133+mimic組組通過轉染miR-625 mimic質粒以過表達miR-625，mimic+LINC01133組和LINC01133組轉染LINC01133質粒過表達CCND1。對照組轉染兩種NC質粒，在轉染24 h后收集細胞進行后續實驗。

1.3.3 qPCR檢測LINC01133、miR-625和CCND1 mRNA：通過qPCR檢測LINC01133、miR-625和CCND1 mRNA水平。通過Trizol獲得細胞中總RNA，然后檢測RNA的純度和濃度。使用cDNA試劑盒將1 μg RNA逆轉錄合成cDNA(42℃下60 min，70℃下5 min，然后4℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix進行qPCR實驗(在95℃/10 min，40個循環，94℃/15 s，60℃/1 min,60℃/1 min，4℃保存)。GAPDH作為mRNA和LncRNA的內參，U6作為miRNA的內參，通過比較循環閾值(ΔΔCt)用于分析RNA的表達。

1.3.4 Western blot：通過Western blot檢測CCND1 蛋白的表達水平。在液氮下將細胞研磨，在液氮保護下使用RIPA裂解緩沖液裂解，并使用BCA蛋白測定試劑盒測量總蛋白含量。然后使用SDS-PAGE分離等量的總蛋白(120 V下電泳90 min)，然后將蛋白轉移到PVDF膜上(50 V,120 min)，在含有5%脫脂牛奶的封閉溶液中封閉。然后將PDVF膜與一抗(1∶1 000稀釋)在4℃孵育過夜，然后加入1∶5 000稀釋的HRP偶聯二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，并使用ImagePD軟件使用GAPDH作為內參對蛋白條帶的灰度進行定量。

1.3.5 CCK-8檢測細胞活力：將2×104個細胞接種在96孔板(每孔100 μl)，在培養第48 h加入10 μl CCK-8試劑并在37℃下培養，通過酶標儀檢測450 nm處的吸光度計算相對細胞活力。

1.3.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移：將4組細胞消化后分別接種在6孔板中，每孔1×106個，然后在37℃，5% CO2，相對濕度100%條件下培養直至90%左右匯合。然后使用200 μl移液槍頭從上至下做劃痕，將劃掉的細胞洗去。然后在相同條件下繼續培養24 h。使用倒置顯微鏡觀察并獲得圖像，測量細胞前緣移動距離的百分比(=兩端前緣移動距離/劃痕寬度×100%)。

1.3.7 Transwell檢測細胞侵襲：在Transwell小室的上室加入基質膠，底室加入完全培養基，然后將3×104個細胞加入至上室培養48 h。48 h后洗去未侵入底室的細胞。然后將細胞使用20%甲醇固定，并用0.2%結晶紫染色。在倒置顯微鏡下計數每個視野侵入底部室的細胞數目。

2 結果

2.1 生物信息學分析結果 TCGA數據庫中，胰腺癌患者的LINC01133水平顯著高于正常膀胱組織(P<0.05)。并且高水平的LINC01133與更低的生存率和無進展生存期有關(P<0.05)。見圖1。

2.2 LINC01133直接靶向miR-625 通過雙熒光霉素實驗結果驗證同時轉染miR-625 mimic和LINC01133-wt的細胞的熒光酶素活性顯著降低(P<0.05)。見圖2，表1。

表1 LINC01133直接靶向miR-625的雙熒光素酶報告結果(相對熒光強度)

2.3 4組細胞中LINC01133和miR-625水平比較 LINC01133組和LINC01133+mimic組LINC01133水平顯著高于對照組(P<0.05)，mimic組的miR-625水平顯著高于對照組(P<0.05)。LINC01133組miR-625水平顯著低于對照組，LINC01133+mimic組的miR-625水平顯著高于LICN01133組(P<0.05)。miR-625可逆轉LINC01133對miR-625的抑制作用。見表2。

表2 4組細胞中LINC01133和miR-625水平比較

2.4 4組細胞活力比較 與對照組[(100.00±2.45)%]比較，LINC01133組的細胞活力[(127.69±3.78)%]顯著升高(P<0.05)，mimic組的細胞活力[(80.32±2.06)%]顯著降低(P<0.05)，LINC01133+mimic組的細胞活力顯著低于LINC01133組[(102.54±2.55)%](P<0.05)。

2.5 4組細胞遷移能力比較 LINC01133組的細胞遷移和侵襲能力顯著高于對照組(P<0.05)，mimic組的細胞遷移和侵襲能力顯著低于對照組(P<0.05)，LINC01133+mimic組的細胞遷移和侵襲能力顯著低于LINC01133組(P<0.05)。見表3，圖3、4。

圖3 細胞劃痕實驗檢測4組細胞遷移能力

表3 4組細胞遷移和侵襲能力比較

2.6 miR-625直接靶向抑制CCND1 通過雙熒光霉素實驗結果驗證了同時轉染miR-625 mimic和CCND1-wt的細胞的熒光酶素活性顯著降低(P<0.05)。并且mimic組的CCND1 mRNA和蛋白的水平顯著低于對照組(P<0.05)。見表4，圖5、6。

圖5 miR-625直接靶向CCND1的結合位點

圖6 Western blot檢測CCND1蛋白的表達

表4 miR-625直接靶向CCND1的雙熒光素酶報告結果(相對熒光強度)

2.7 4組CCND1 mRNA和蛋白水平比較 LINC01133組的CCND1 mRNA和蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)，mimic組的CCND1 mRNA和蛋白水平顯著低于對照組(P<0.05)，LINC01133+mimic組的CCND1 mRNA和蛋白水平顯著低于LINC01133組(P<0.05)。見表5，圖7。

圖7 Western blot檢測CCND1蛋白的表達

表5 4組CCND1 mRNA和蛋白水平比較

3 討論

2018年的一項全球性的癌癥統計結果顯示，2017年胰腺癌的新發病例458 918例，占所有腫瘤的2.5%，2017年死于胰腺癌的患者共432 242例，占所有腫瘤的4.5%[6]。胰腺癌為臨床上常見的消化道腫瘤，具有惡性高、預后差的特點，胰腺癌患者5年的生存率僅10%左右[7]。內窺鏡超聲檢查/磁共振成像檢查和計算機斷層掃描是檢測胰腺癌的常用手段。胰腺癌的復發和轉移是導致預后不佳和患者死亡的主要因素，探究胰腺癌細胞遷移和侵襲的機制具有重要意義。

miRNA在腫瘤中的作用被廣泛揭示，miRNA可通過堿基配對的方式直接靶向靶基因的mRNA的3’端的非翻譯區域，并引起mRNA的降解和翻譯抑制，從而轉錄后水平上調節基因的表達，調控細胞生物學行為[8]。而miRNA的功能又受到LncRNA的靶向調控，LncRNA可以通過競爭內源性RNA的方式作為“海綿”“吸附”miRNA，從而抑制miRNA的生物學功能，從而調節miRNA在mRNA降解和翻譯中的作用[9]。LncRNA通過靶向miRNA調節靶基因表達也是調節腫瘤細胞發生和發展的重要機制之一。LINC01133是一種新發現的與腫瘤相關的LncRNA，Zeng等[10]研究顯示LINC01133可作為“海綿”吸附miR-422a并促進骨肉瘤的進展。Zheng等[11]研究顯示在肝細胞癌中，LINC01133可通過激活PI3K/AKT通路促進細胞惡性增殖。并且LINC01133會通過靶向miR-4784促進其靶基因AHDC1的表達，從而促進宮頸癌細胞的轉移[12]。也有研究顯示在結直腸癌和乳腺癌等中，LINC01133具有抑癌作用[13,14]。本研究中，我們首先通過生物信息學分析了LINC01133在胰腺癌中的表達特點，結果顯示其顯著高于正常膀胱組織，并且高水平的LINC01133與更低的生存率和無進展生存期有關。并且進一步的研究結果也顯示過表達LINC01133促進胰腺癌細胞的活力、遷移和侵襲的能力。這說明在胰腺癌中，LINC01133具有促進胰腺癌進展的作用。

此外，本研究還發現LINC01133直接靶向miR-625，并且miR-625直接靶向抑制CCND1 mRNA和蛋白的表達水平。此外，通過細胞實驗也證實了過表達LINC01133抑制miR-625的水平并上調CCND1 mRNA和蛋白的表達，并且過表達miR-625會阻斷LINC01133對miR-625的抑制作用和對CCND1的促進作用，這提示在胰腺癌細胞中，存在LINC01133/miR-625/CCND1調節途徑。并且進一步的細胞學實驗結果也顯示了miR-625抑制細胞活力、遷移和侵襲，并且阻斷了LINC01133對細胞生長、遷移和侵襲的促進作用。Wang等[15]研究顯示下調miR-625會通過靶向促進SOX2的表達促進食道癌細胞的增殖和侵襲。Gong等[16]發現miR-625可通過靶向抑制ALDH1A1逆轉胃癌細胞的多藥耐藥性。并且miR-625的作用受到LncRNA的靶向調控[17]。CCND1不但具有調控細胞周期和細胞生長的做用，還具有促進腫瘤轉移的作用[18,19]，說明LINC01133促進胰腺癌細胞遷移和侵襲的機制可能通過靶向調節miR-625/CCND1實現。

綜上所述，在胰腺癌中，LINC01133具有促癌作用，并且LINC01133可能通過靶向miR-625促進CCND1的表達水平，從而促進胰腺癌細胞生長、遷移和侵襲。